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Eine neuartige Spleißvariante von Elp3/Kat9 reguliert die Modifikation und Funktion der mitochondrialen tRNA

Oct 23, 2023

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 14804 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Posttranslationale Modifikationen wie die Acetylierung von Lysin regulieren die Aktivität verschiedener Proteine ​​​​in vielen Zellkompartimenten. Die Proteindeacetylierung in Mitochondrien wird durch die enzymatische Aktivität der NAD+-abhängigen Deacetylase Sirtuin 3 (SIRT3) katalysiert. Es bleibt jedoch unklar, ob entsprechende mitochondriale Acetyltransferasen existieren. Wir verwendeten einen bioinformatischen Ansatz, um nach mitochondrialen Proteinen mit einer katalytischen Acetyltransferase-Domäne zu suchen, und identifizierten eine neue Spleißvariante von ELP3 (mt-ELP3) des Elongator-Komplexes, die sich in der mitochondrialen Matrix in Säugetierzellen lokalisiert. Unerwarteterweise vermittelt mt-ELP3 nicht die Acetylierung mitochondrialer Proteine, sondern induziert stattdessen eine posttranskriptionelle Modifikation von mitochondrialen Transfer-RNAs (mt-tRNAs). Die Überexpression von mt-ELP3 führt zum Schutz von mt-tRNAs vor der tRNA-spezifischen RNase Angiogenin, erhöht die mitochondriale Translation und erhöht darüber hinaus die Expression von OXPHOS-Komplexen. Diese Studie identifiziert mt-ELP3 somit als ein nicht-kanonisches mt-tRNA-modifizierendes Enzym.

Die Lysinacetylierung ist ein wichtiger Regulator mehrerer Proteine, die sich in verschiedenen Zellkompartimenten befinden, einschließlich mitochondrialer Stoffwechselenzyme1. Diese reversible posttranslationale Modifikation wird durch konkurrierende Lysin-Acetyltransferasen (KATs) und Deacetylasen (KDACs) gesteuert, die die Addition bzw. Entfernung einer Acetylgruppe an einem Lysinrest katalysieren2. Wir haben zuvor gezeigt, dass SIRT3 eine mitochondriale NAD+-abhängige Proteindeacetylase ist, die den Energiestoffwechsel steuert3. Diese Erkenntnisse motivierten uns, nach entsprechenden mitochondrialen KAT(s) zu suchen. Da die mitochondriale Matrix eine höhere Acetyl-CoA-Konzentration und einen höheren pH-Wert als andere Zellkompartimente aufweist, wurde vorgeschlagen, dass die mitochondriale Acetylierung über einen nicht-enzymatischen Mechanismus erfolgt1. Dieser Mechanismus schließt jedoch die Existenz eines mitochondrialen KAT nicht aus. Tatsächlich sind GCN5L1 (allgemeine Kontrolle der Aminosäuresynthese 5)-like 1 und ACAT1 (Acetyl-CoA-Acetyltransferase 1) plausible mitochondriale KATs4,5.

Hier haben wir einen bioinformatischen Ansatz verwendet, um nach mitochondrialen Proteinen mit einer katalytischen Acetyltransferase-Domäne zu suchen. Diese Analyse führte zur Identifizierung einer neuen Spleißvariante des Elongator-Proteins 3 (ELP3), auch bekannt als KAT9, der bekannten katalytischen Untereinheit des Transkriptions-Elongator-Komplexes aus sechs Untereinheiten (Elp1–Elp6). ELP3 verfügt über zwei mutmaßliche enzymatische Domänen: Die radikalische S-Adenosylmethionin (SAM)-Domäne enthält Eisen-Schwefel [4Fe–4S], einen Cluster, der für die Methylierung von tRNAs durch reduktive SAM-Spaltungsaktivität6,7,8,9 wichtig ist, und einen C-Terminus KAT-Domäne mit Sequenzähnlichkeit zur Superfamilie der GCN5-ähnlichen Acetyltransferasen. Somit könnte ELP3 Histone10 und andere Proteinziele acetylieren und dabei Acetyl-CoA als Cofaktor11 verwenden. Allerdings kann ELP3 auch zytoplasmatische (Cyt)-tRNAs modifizieren12,13. In dieser Hinsicht ist ELP3 erforderlich, um in vielen Cyt-tRNAs die Modifikationen 5-Methoxycarbonylmethyl-2-thiouridin (mcm5s2U34) und 5-Carbamoylmethyl-2-thiouridin (ncm5s2U34) der Wobble-Uridine U34 (Position 34) zu bilden Ziele12,13,14. Diese posttranskriptionellen tRNA-Modifikationen sind für die Genauigkeit und Effizienz der Proteintranslation notwendig15,16, und das Fehlen dieser Modifikationen führt zu einer Vielzahl menschlicher Krankheiten17,18. Insbesondere ist eine Fehlregulation der tRNA-Modifikationsaktivität von ELP3 hauptsächlich mit neurologischen Störungen verbunden19,20.

In der vorliegenden Studie charakterisieren wir diese neuartige Spleißvariante von ELP3 (mt-ELP3) und liefern den Beweis, dass sich mt-ELP3, jedoch nicht andere Varianten, in den Mitochondrien lokalisieren. Unerwarteterweise ist mt-ELP3 nicht an der Acetylierung mitochondrialer Proteine ​​beteiligt, sondern an der posttranskriptionellen Modifikation mitochondrialer (mt)-tRNAs. Wir zeigen, dass eine Überexpression von mt-ELP3 zum Schutz von mt-tRNAs vor der tRNA-spezifischen RNase Angiogenin führt und die Mitochondrienfunktion verbessert, indem die mitochondriale Translation, die Expression von Komplexen des oxidativen Phosphorylierungssystems (OXPHOS) und die mitochondriale Atmung erhöht werden. Bemerkenswert ist, dass mt-ELP3 im Gehirn stark exprimiert wird, was darauf hindeutet, dass es in diesem Gewebe eine wichtige Rolle spielen könnte. Insgesamt identifizieren unsere Ergebnisse mt-ELP3 als ein nicht-kanonisches mt-tRNA-modifizierendes Enzym.

Um neue mitochondriale KATs zu identifizieren, suchten wir nach KAT-, NAT- (N-Acetyltransferase) und NAA-Spleißprodukten (N-Alpha-Acetyltransferase) im Amigo (http://amigo.geneontology.org/amigopaap), Panther (http:/ /www.pantherdb.orgke) und Kegg (https://www.genome.jp/kegg/pathway.html) Pathway-Datenbanken und21. Diese Analyse führte zur Identifizierung von 55 Genen, die eine mutmaßliche Acetyltransferase-Domäne im menschlichen Genom kodieren. Unter Verwendung der Ensemble-Datenbank haben wir 276 gespleißte Isoformen für alle Kandidaten extrahiert und eine in silico mitochondriale Targeting-Analyse mit TargetP (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TargetP-2.0), Predotar (http://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TargetP-2.0) durchgeführt. /urgi.versailles.inra.fr/predotar/predotar.html) und Wolfpsort (https://wolfpsort.hgc.jp) Datenbanken. Jede gespleißte Isoform wurde willkürlich bewertet (die Strategie ist in Abb. S1 dargestellt). Zu den 20 potenziellen mitochondrialen KAT-Isoformen gehören drei Spleißvarianten von ELP3 (Ergänzungstabelle 1 und Abb. S2): ELP3/Kat9 203 gespleißte Isoform (ENSP00000439242), ELP3/Kat9 202 gespleißte Isoform (ENSP00000445558) und ELP3/Kat9 003 gespleißte Isoform Formular ( ENSP00000429180). Bemerkenswert ist, dass die gespleißten Isoformen 202 und 203 das gleiche Startcodon haben (Abb. S2). Daher haben wir die gespleißten Isoformen 203 und 003 für nachfolgende Studien in Betracht gezogen. Nachfolgende Studien konzentrierten sich auf die mitochondriale Lokalisierung dieser Isoformen und ihre Funktion in Mitochondrien.

ELP3 befindet sich vorwiegend im Zytoplasma22,23,24, kann aber auch in den Mitochondrien lokalisiert sein25,26. Um die subzelluläre Lokalisierung von ELP3 zu bestimmen, wurden kanonisches ELP3 (ELP3-ORF1), gespleißte Isoform 003 (ELP3-ORF2) und gespleißte Isoform 203 (ELP3-ORF3) (Abb. S2 und S3) C-terminal mit einem FLAG-Epitop markiert im pcDNA T0-Vektor und transient in HeLa-Zellen unter Verwendung von pcDNA T0 exprimiert. Die Immunfluoreszenzanalyse zeigte, dass nur FLAG-markiertes ELP3-ORF3 zusammen mit dem mitochondrialen Marker cox IV lokalisiert war (Abb. 1A), was bestätigte, dass nur diese Isoform (im Folgenden als mt-ELP3 bezeichnet) in Mitochondrien lokalisiert ist. Um die submitochondriale Lokalisierung von mt-ELP3 zu untersuchen, verwendeten wir einen Proteinase-K-Sensitivitätstest. Ein Tetracyclin-reguliertes Expressionssystem wurde für die induzierbare mt-ELP3-Proteinexpression in HEK293T-Zellen verwendet, und isolierte Mitochondrien aus diesen Zellen (Abb. 1B) wurden mit steigenden Konzentrationen von Digitonin (mildes Detergens) in Gegenwart von Proteinase K behandelt. Mt- ELP3 war vor der Spaltung durch Proteinase K geschützt, außer in hohen Konzentrationen von Digitonin, das die Mitochondrienmembranen auflöst (Abb. 1C). Diese Empfindlichkeit war ähnlich der des Matrixproteins HSP60 (Abb. 1C). Im Gegensatz dazu reagierte TOM20, ein mitochondriales Außenmembranprotein, auch in Abwesenheit von Digitonin empfindlich auf Proteinase K (Abb. 1C). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass mt-ELP3 ein mitochondriales Matrixprotein ist.

Die ELP3-203-Isoform ist ein mitochondriales Matrixprotein. (A) Subzelluläre Lokalisierung von ELP3 in Mitochondrien. HeLa-Zelllinien wurden vorübergehend mit den Plasmiden pcDNA ELP3-ORF1, pcDNA ELP3-ORF2 und pcDNA ELP3-ORF3 transfiziert. Die intrazelluläre Verteilung der Proteine ​​ELP3-ORF1, ELP3-ORF2 und ELP3-ORF3 wurde mit einem monoklonalen Primärantikörper gegen Flag und Alexa Fluor-488 (grüne Fluoreszenz) nachgewiesen. Die Expression von COXIV (mitochondrialer Marker) in denselben Zellen wurde mit einem monoklonalen Antikörper gegen COXIV und Alexa Fluor 594 (rote Fluoreszenz) bewertet. Die rechten Felder zeigen zusammengeführte Bilder für COXIV-Farbstoff und endogen exprimiertes Protein ELP3-ORF1, ELP3-ORF2 und ELP3-ORF3 in HeLa-Zellen. Die gelbe Farbe zeigt die Kolokalisierung von COXIV mit ELP3-ORF1, ELP3-ORF2 und ELP3-ORF3. Kerne (blau) wurden mit DAPI visualisiert. Diese Bilder sind repräsentativ für drei separate Experimente. Das beigefügte Histogramm zeigt die quantitative Analyse von ELP3-ORF1, ELP3-ORF2 und ELP3-ORF3, kolokalisiert mit dem COXIV-Marker in HeLa-Zellen, anhand des Pearson-Korrelationskoeffizienten. Alle Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung von mindestens drei Experimenten. ***p < 0,001. ns: nicht signifikant. (B) Western-Blot-Analyse des mt-ELP3-Proteins in der mitochondrialen Fraktion von T-REx-293-Zellen, die mit Tetracyclin (+Tet) oder nicht (-Tet) behandelt wurden. GAPDH und COXIV wurden als zytosolische bzw. mitochondriale Proteinmarker verwendet. (C) Proteinase-K-Empfindlichkeit von mt-ELP3. Gereinigte Mitochondrien aus Zellen, die mt-ELP3 überexprimierten, wurden unbehandelt gelassen (–), mit Proteinase K behandelt (+) oder mit Proteinase K in Gegenwart steigender Konzentrationen von Digitonin oder Proteinase K mit 0,3 % Triton X-100 behandelt. HSP60 und TOM20 wurden als mitochondrialer Mitoplasten- bzw. Außenmembranmarker verwendet.

ELP3 enthält eine Histon/Lysin-Acetyltransferase-Domäne in seinem Carboxy-Terminus mit signifikanter Homologie zur katalytischen Domäne der GNAT-Familie (Gcn5-verwandte N-terminale Acetyltransferase) von Acetyltransferasen10. ELP3 acetyliert Histone10 und andere Nicht-Histone-Proteine11,23. Die Protein-Lysin-Acetylierung ist ein wichtiger Regulierungsmechanismus von Stoffwechselenzymen in den Mitochondrien27,28,29.

Da mt-ELP3 über eine Acetyltransferasedomäne verfügt, vermuteten wir, dass es den Acetylierungsstatus mitochondrialer Proteine ​​beeinflussen könnte. Um diese Hypothese zu testen, haben wir die globalen mitochondrialen Acetylierungsniveaus in Kontrollzellen und Zellen, die mt-ELP3 überexprimieren, mithilfe von zwei verschiedenen Methoden bewertet: Western Blot und Massenspektrometrie. Die Western-Blot-Analyse mit einem kommerziellen Pan-Acetyllysin-Antikörper ergab keine globale Veränderung der Acetylierungsniveaus des mitochondrialen Proteins in Zellen, die mt-ELP3 überexprimieren, im Vergleich zu Kontrollzellen (Abb. 2). Die massenspektrometrische Analyse zeigte auch keine globale Veränderung des mitochondrialen Acetylierungsgrads in Zellen, die mt-ELP3 überexprimieren, im Vergleich zu Kontrollzellen (Ergänzungstabelle 2).

Die Überexpression von mt-ELP3 hat keinen Einfluss auf die Acetylierung des mitochondrialen Proteins. Western-Blot-Analyse des Lysin-Acetylierungsstatus (Ac-K) in mitochondrialen und zytoplasmatischen Fraktionen, die aus T-REx-293-Zellen isoliert wurden, die mit Tetracyclin behandelt (+Tet) oder nicht (−Tet) waren. Ponceau wurde als Ladekontrolle eingesetzt.

Als nächstes testeten wir, ob mt-ELP3 an mt-tRNA-Modifikationen beteiligt ist. ELP3 katalysiert nicht nur die Acetylierung von Lysinresten in Peptiden und Proteinen, es fungiert auch als nicht-kanonisches tRNA-modifizierendes Enzym13,30. In Eukaryoten ist kanonisches ELP3 für die Synthese von 5-Methoxycarbonylmethyl- (mcm5) und 5-Carbamoylmethyl- (ncm5) Seitenketten auf Uridinen an der Wobble-Position (Position 34 in der tRNA) einer Untergruppe von Cyt-tRNAs12 erforderlich. Die mcm5U34-modifizierte Wobble-Base wird in tRNALys UUU, tRNAGlu UUC und tRNAGln UUG31 weiter zu 5-Methoxycarbonylmethyl-2-thiouridin (mcm5S2U) thioliert, und das Vorhandensein einer mcm5- oder ncm5-Seitenkette ist eine Voraussetzung für eine effiziente Thiolierung in diesen Zytostatika. tRNAs32. Entsprechende mt-tRNAs werden auch an der Wobble-Uridinposition modifiziert, bei der es sich um 5-Taurinomethyl-2-thiouridin (τm5S2U) handelt 33.

Um eine mögliche Rolle von mt-ELP3 bei der Modifizierung von mt-tRNAs zu bewerten, analysierten wir die Empfindlichkeit gegenüber der Verdauung mit der tRNA-spezifischen RNase Angiogenin von mt-tRNAGlu, mt-tRNALys und mt-tRNALeu (mit der τm5U-Modifikation) und mt-tRNAVal (ohne die τm5U-Modifikation) aus Kontrollzellen und aus Zellen, die mt-ELP3 überexprimieren. tRNAs, denen die Modifikation an der Wobble-Position fehlt, reagieren empfindlicher auf eine Angiogenin-vermittelte Verdauung als die entsprechenden modifizierten tRNAs34,35,36. Nach In-vitro-Angiogenin-Verdau der Gesamt-RNA, die aus Kontrollzellen und mt-ELP3 überexprimierenden Zellen gereinigt wurde, wurden die verdauten Produkte mithilfe einer Northern-Blot-Analyse mit einer spezifischen Digoxigenin (DIG)-markierten Oligodesoxynukleotidsonde für die genannten mt-tRNAs analysiert. Mt-tRNAGlu, mt-tRNALys und mt-tRNALeu (UUR) aus Kontrollzellen reagierten empfindlicher auf die Angiogenin-vermittelte Spaltung als solche aus Zellen, die mt-ELP3 überexprimierten (Abb. 3A). Im Gegensatz dazu fanden wir keine Unterschiede in den Verdauungsmustern von mt-tRNAVal (das keine τm5U-Modifikation trägt) (Abb. 3A). Diese Ergebnisse stimmen mit dem Modell überein, dass mt-ELP3 die Synthese oder Stabilität der τm5U-Modifikation in diesen mt-tRNAs erhöht.

Die Überexpression von mt-ELP3 schützt das mt-tRNA-Substrat vor der Angiogenin-vermittelten Spaltung, ohne die 2-Thiolierungsniveaus zu verändern. (A) und (B) Northern-Analyse von mt-tRNALys, mt-tRNALeu, mt-tRNAGlu und mt-tRNAVal nach In-vitro-Angiogenin-Verdau kleiner RNAs, gereinigt aus Kontrollzellen und Zellen, die mt-ELP3 (A) überexprimieren, und aus der Kontrolle Zellen und Zellen, die mt-ELP3 mut (B) für die angegebenen Zeiten überexprimieren. Das beigefügte Histogramm zeigt die kinetische Analyse der Angiogenin-Verdauungen. Die Mengen an intakter mt-tRNA nach 0, 10, 20 und 30 Minuten Inkubation mit Angiogenin werden als fache Änderungen im Vergleich zur unverdauten Kontrolle (0 Minuten) dargestellt. Alle Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung von mindestens drei Experimenten. *p < 0,05. (C) APM-Northern-Analyse der 2-Thiolierung von mt-tRNALys, mt-tRNALeu und mt-tRNAGlu aus Kontrollzellen und Zellen, die mt-ELP3 überexprimieren. Die gleichen Mengen an Gesamt-RNA (5 µg) wurden in einem denaturierenden Polyacrylamid-Harnstoff-Gel in Gegenwart (+) oder Abwesenheit (–) von APM laufen gelassen. Die thiolierten tRNAs wurden in Gegenwart von APM als verzögerte Banden nachgewiesen. Die APM (-)-Membran wurde mit 5S-rRNA als Beladungskontrolle sondiert. (D) mt-ELP3 interagiert mit GTPBP3. HEK 293T-Zellen wurden wie angegeben mit pcDNA-mt-ELP3-Flag- und pCMV6-GTPBP3-Plasmiden co-transfiziert, und die Lysate wurden mit Anti-Flag-Antikörper immunpräzipitiert. Ausgefällte Proteine ​​wurden mit Anti-ELP3-, GTPBP3- und VDAC-Antikörpern immungeblottet. Als Negativkontrolle 1 bzw. 2 wurden mit Lysat ohne Anti-Flag-Antikörper gemischte Perlen und mit Anti-Flag-Antikörper gemischte Perlen ohne Lysat verwendet.

Um zu testen, ob die KAT-Domäne von mt-ELP3 für die mt-tRNA-Modifikation notwendig ist, haben wir ein mutiertes mt-ELP3-Konstrukt (mt-ELP3 mut) generiert, indem wir eine (GFG → FAF)-Mutation in seine KAT-Domäne 37,38 eingeführt haben (Abb . S4, S5). Wir fanden keine Unterschiede in der Angiogenin-vermittelten Spaltung von RNA aus Kontrollzellen und Zellen, die mt-ELP3 mut überexprimieren (Abb. 3B), was darauf hinweist, dass die KAT-Domäne von mt-ELP3 für seine mt-tRNA-Funktion essentiell ist.

Die τm5U34-Modifikation wird in mt-tRNALys, mt-tRNAGlu und mt-tRNAGln39,40 weiter zu τm5S2U thioliert. Wir fragten, ob mt-ELP3 auch die 2-Thiouridylierung in diesen mt-tRNAs beeinflusst. Die Thiolierung von U34 kann durch Northern Blot in Gegenwart von [(N-Acryloylamino)phenyl]quecksilberchlorid (APM) nachgewiesen werden. In dieser Analyse interagieren die im Gel polymerisierten APM spezifisch mit tRNAs, die Thiolgruppen enthalten, und verzögern dadurch deren Migration41,42. Die 2-Thiouridylierungsniveaus von mt-tRNAGlu und mt-tRNALys in Zellen, die mt-ELP3 überexprimieren, waren mit denen in Kontrollzellen vergleichbar (Abb. 3C). Im Gegensatz dazu wurde bei mt-tRNALeu, das von Natur aus nicht thioliert ist, keine Verzögerung beobachtet. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass mt-ELP3 die Thiolierung an Position 2 von mt-tRNAs nicht beeinflusst.

Überexpression (Abb. S6A) oder Herunterregulierung (Abb. S6B) von kanonischem ELP3 führt zu einem Anstieg bzw. Abfall des 2-Thiol-Spiegels in Cyt-tRNAs (Abb. S6C, D); Die Überexpression von mt-ELP3 erhöhte jedoch nicht den Thiolspiegel in mt-tRNAs (Abb. 3C), was die Annahme stützt, dass sowohl τm5- als auch 2-Thiolmodifikationen in mt-tRNAs unabhängig voneinander abzulaufen scheinen, ähnlich wie in veröffentlichten Berichten 43, 44. Es wird angenommen, dass die kernkodierten tRNA-modifizierenden Enzyme MTO1 und GTPBP3 für die Synthese der τm5U34-Modifikation in mt-tRNAs verantwortlich sind, die für Lys, Leu, Glu, Gln und Trp45 kodieren. Basierend auf unseren Beobachtungen, dass mt-ELP3 an der Synthese von τm5U beteiligt zu sein scheint, haben wir vorhergesagt, dass mt-ELP3 sowohl mit GTPBP3 als auch mit MTO1 interagiert. Die massenspektrometrische Analyse von Proteinen, die gemeinsam mit mt-ELP3-FLAG immunpräzipitieren, führte zur Identifizierung von GTPB3 (Daten nicht gezeigt). Um diese Wechselwirkung zu bestätigen, exprimierten wir GTPBP3 und mt-ELP3 mit Flag-Tag in HEK293T-Zellen gemeinsam und stellten fest, dass GTPBP3 durch Herunterziehen mit einem Flag-Tag-Antikörper nachgewiesen werden konnte (Abb. 3D). Diese Ergebnisse bestätigen die Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen mt-ELP3 und GTPBP3.

Eine Taurinmodifikation an U34 (τm5S2U34) ist entscheidend für die Regulierung der mitochondrialen Translationseffizienz und der Genauigkeit der Codon-Anticodon-Interaktion46, und der GTPBP3-Defekt verursacht einen Mangel an mitochondrialer Translation44,47. Wir kamen daher zu dem Schluss, dass eine Überexpression von mt-ELP3 die mitochondriale Translation erhöhen könnte. Um die mitochondriale Translationsaktivität zu untersuchen, verwendeten wir ein Klick-Chemie-Experiment mit nicht radioaktiver Pulsmarkierung48. Insbesondere behandelten wir Kontrollzellen und Zellen, die mt-ELP3 überexprimierten, mit dem Alkin-Methionin-Derivat L-Homopropargylglycin (HPG), mit oder ohne Cycloheximid (spezifischer Inhibitor der zytosolischen Translation) und/oder Chloramphenicol (ein spezifischer Inhibitor der mitochondrialen Translation). Das Methionin-Analogon HPG wurde anstelle von Methionin in entstehendes Protein eingebaut und anschließend mithilfe chemoselektiver Fluoreszenzmarkierung mittels Klick-Chemie sichtbar gemacht48,49.

Wie vorhergesagt, war die mitochondriale Translation in Zellen, die mt-ELP3 überexprimierten, im Vergleich zu Kontrollzellen erhöht (Abb. 4A, Mitte rechts und B (HPG + CHX)). Bemerkenswert ist, dass der Anstieg durch die Behandlung mit Chloramphenicol beseitigt wurde, was darauf hinweist, dass das Cycloheximid-resistente Signal ausschließlich neu synthetisierte mitochondriale Proteine ​​darstellt (Abb. 4A, rechts und B (HPG + CHX + CHL)). Ohne HPG wurde jedoch kein Signal erkannt (Abb. 4A, links). Darüber hinaus war die Gesamtmenge neu synthetisierter Proteine ​​(zytosolisch und mitochondrial) in Zellen, die mt-ELP3 überexprimierten, größer als in Kontrollzellen, was durch das HPG-Signal ohne Cycloheximid und Chloramphenicol belegt wurde (Abb. 4A, Mitte links und B (HPG)). Zur Unterstützung der HPG-Signalmessungen haben wir auch das HPG-Signal in Kontrollzellen und Zellen, die mt-ELP3 überexprimieren, mit Cycloheximid (mitochondriale Translation) mittels Durchflusszytometrie quantifiziert. Wir fanden in Zellen, die mt-ELP3 überexprimierten, deutlich mehr HPG-Signale als in Kontrollzellen, was mit den Daten aus der Fluoreszenzmikroskopie übereinstimmt (Abb. 4C, D). Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass eine Überexpression von mt-ELP3 die mitochondriale Translationsrate erhöht.

Eine Überexpression von mt-ELP3 führt zu einer Erhöhung der mitochondrialen Translation. (A), (B), (C) und (D) Bewertung der mitochondrialen Translation. Die mitochondriale De-novo-Proteinsynthese wurde in HEK293T-Zellen sichtbar gemacht, die vorübergehend mit leerem Plasmid (pcDNA T0) oder mt-ELP3-Plasmid (pcDNA mt-ELP3) transfiziert wurden, durch Inkubation mit oder ohne HPG (1 Stunde) und mit oder ohne Cycloheximid (CHX) und/ oder Chloramphenicol (CHL). Nach 1 Stunde wurden die Zellen fixiert, der Klickreaktion unterzogen und mittels Fluoreszenzmikroskopie (A) oder Durchflusszytometrie (C) auf den fluoreszenzmarkierten HPG-Einbau analysiert. Das HPG-Signal wurde berechnet und grafisch dargestellt (B, D). Alle Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung von mindestens drei Experimenten. *p < 0,05. ns: nicht signifikant.

Die mitochondriale Translation ist für die Synthese von 13 mitochondrial kodierten Untereinheiten von OXPHOS verantwortlich. Um eine mögliche Rolle bei OXPHOS zu beurteilen, haben wir die Steady-State-Spiegel von OXPHOS-Komplexen durch Blue-Native-Gelelektrophorese gemessen (Abb. 5A). Interessanterweise waren die Spiegel von Komplex I (CI), Komplex III (C III), Komplex IV (C IV) und Komplex V (CV) in Zellen, die mt-ELP3 überexprimierten, höher als in Kontrollzellen (Abb. 5B). Wichtig ist, dass die Überexpression von mt-ELP3 mut keinen Einfluss auf die Expression dieser Komplexe hatte (Abb. 5C, D). Bemerkenswerterweise ging die erhöhte Expression von OXPHOS-Komplexen in Zellen, die mt-ELP3 überexprimierten, mit einem Anstieg der Steady-State-Spiegel der mitochondrial kodierten OXPHOS-Untereinheiten einher (Abb. 5E). Bei Überexpression von mt-ELP3 mut wurde keine Veränderung der Spiegel der mitochondrial kodierten OXPHOS-Untereinheiten beobachtet (Abb. 5E).

Eine Überexpression von mt-ELP3 führt zu einer Erhöhung der Expression mitochondrialer OXPHOS-Komplexe und der mitochondrialen Atmung. (A) und (C) Repräsentatives BN-PAGE-Gel, gefärbt mit Coomassie Brilliant Blue, von Atmungskomplexen, gereinigt aus Kontrollzellen (pcDNA T0) und Zellen, die mt-ELP3 überexprimieren (pcDNA mt-ELP3) (A) und aus Kontrollzellen (pcDNA). T0) und Zellen, die die mt-ELP3-Mutante (pcDNA mt-ELP3 mut) überexprimieren (C). Pro Vertiefung wurde ein 20-µg-Aliquot jeder Probe geladen. Ein 5-µL-Aliquot des ungefärbten NativeMark-Proteinstandards (Marker) wurde geladen. (B) und (D) Repräsentative Blue Native-PAGE von OXPHOS-Komplexen in HEK293T-Zellen, transfiziert mit pcDNA4 T0 oder pcDNA mt-ELP3 (B) und mit pcDNA4 T0 oder pcDNA mt-ELP3 mut (D). Die Streudiagramme zeigen die densitometrischen Messungen von OXPHOS-Komplexen, normalisiert auf Komplex-II (Beladungskontrolle) und dargestellt als fache Änderung relativ zu Kontrollzellen. (E) Repräsentative Immunoblots der mitochondrialen OXPHOS-Untereinheiten ND1 (Komplex I), MTCO1 (Komplex IV), CytB (Komplex III), ATP5A (Komplex V) und SDHA (Komplex II) in HEK293T-Zellen, transfiziert mit pcDNA4 T0, pcDNA mt-ELP3 oder pcDNA-mt-ELP3 mut. Die Membranen wurden außerdem mit einem Antikörper gegen ELP3 und b-Actin sondiert, B-Actin wurde als Beladungskontrolle verwendet. (F) und (G) Sauerstoffverbrauchsrate (OCR). Gleiche Anzahlen von HEK293T-Zellen, die vorübergehend mit pcDNA T0 oder pcDNA mt-ELP3 transfiziert wurden, wurden Sauerstoffverbrauchsmessungen in einem extrazellulären Flussanalysator Seahorse XF96 mit aufeinanderfolgenden Zugaben der metabolischen Inhibitoren/Aktivatoren unterzogen: Oligomycin, FCCP, Antimycin A (Ant A) und Rotenon (F) Das Streudiagramm zeigt die basale OCR (bestimmt als Differenz zwischen OCR vor Oligomycin und OCR nach Rotenon/Antimycin A/Rotenon), ATP-verknüpfte OCR (Differenz zwischen OCR vor und nach Oligomycin), maximale OCR, Reservekapazität ( Unterschied zwischen der FCCP-stimulierten Rate und der basalen OCR) und Protonenleck (Unterschied zwischen der basalen OCR und der ATP-verknüpften OCR) in pcDNA T0- und pcDNA mt-ELP3-Zellen (G). Alle Daten sind Mittelwerte ± Standardabweichung von mindestens drei verschiedenen Experimenten. *p < 0,05, **p < 0,01. ns: nicht signifikant.

Als nächstes testeten wir die Auswirkung der mt-ELP3-Überexpression auf die mitochondriale Atmung mithilfe eines extrazellulären Flussanalysators Seahorse XF96 mit einer Reihe von Stoffwechselinhibitoren und Entkopplungsmitteln (Abb. 5F). Wir beobachteten, dass die basale Sauerstoffverbrauchsrate (OCR), die mitochondriale ATP-verknüpfte Kapazität und die Reserveatmungskapazität (ATP, das bei steigendem Energiebedarf genutzt werden kann) in mt-ELP3-überexprimierenden Zellen signifikant höher waren als in Kontrollzellen und es wurde kein Unterschied festgestellt in ATP-Leckmengen zwischen diesen Zellen (Abb. 5G). Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass eine Überexpression von mt-ELP3 die mitochondriale Atmung erhöht.

In der vorliegenden Studie haben wir versucht, mitochondriale Acetyltransferase-Kandidaten mithilfe eines bioinformatischen Ansatzes zu identifizieren. Dies führte zur Identifizierung einer neuen Spleißvariante und Isoform von ELP3, die in der mitochondrialen Matrix lokalisiert ist. Überraschenderweise ist dieses mitochondriale ELP3 (mt-ELP3) nicht an der Acetylierung mitochondrialer Proteine ​​beteiligt, sondern an der posttranskriptionellen Modifikation von mt-tRNAs, wodurch es die Translation und Atmung der mitochondrialen RNA reguliert.

Unsere Ergebnisse zeigten deutlich die Lokalisierung einer kurzen Form von ELP3 im mitochondrialen Mitoplasten. Während frühere Berichte darauf hingewiesen haben, dass sich ELP3 in Mitochondrien lokalisiert26,38, handelt es sich bei einem ELP3-Homologen in Toxoplasma gondii um ein im Schwanz verankertes Protein, das sich aufgrund seiner einzigartigen C-terminalen Transmembrandomäne (TMD) in der äußeren Mitochondrienmembran des Parasiten befindet38. Dem ELP3 von Säugetieren fehlt jedoch eine TMD-Domäne, was darauf hindeutet, dass ein anderer Mechanismus, höchstwahrscheinlich das Vorhandensein von NH2-terminalen mitochondrialen Targeting-Sequenzen, an seinem mitochondrialen Import beteiligt ist.

Die Lokalisierung von ELP3 in den Mitochondrien deutete auf eine neuartige und unbekannte Funktion in diesem Organell hin. Unerwarteterweise führte die Überexpression von mt-ELP3 nicht zu einer Erhöhung der mitochondrialen Lysinacetylierung. Aktuelle Studien haben gezeigt, dass ELP3 als nicht-kanonische Acetyltransferase fungiert, die Reaktionen auf tRNAs anstelle von Proteinen katalysiert13,30,50. Daher gilt ELP3 heute als tRNA-modifizierendes Enzym, das den ersten Schritt bei der Bildung von mcm5U, mcm5s2U und ncm5U auf Uridinen in der Wobble-Base-Position einer Untergruppe zytosolischer tRNAs katalysiert13.

Wir gingen davon aus, dass mt-ELP3 an der posttranskriptionellen Modifikation von mt-tRNAs beteiligt sein könnte. Wie zytoplasmatische tRNAs ist auch eine Untergruppe mitochondrialer tRNAs an der U34-Position modifiziert. Eine τm5S2U-Modifikation ist das mitochondriale Gegenstück zu mcm5s2U (Suzuki & Suzuki, 2014). In Übereinstimmung mit der Hypothese, dass mt-ELP3 mitochondriale tRNAs modifizieren könnte, fanden wir heraus, dass die Überexpression von mt-ELP3 die Empfindlichkeit von mt-tRNALeu, mt-tRNALys und mt-tRNAGlu gegenüber der Angiogenin-Verdauung verringert, was auf eine regulatorische Rolle von mt-ELP3 bei der Modifizierung hinweist τm5S2U34. Bemerkenswert ist, dass ein Defekt in MTO1 und/oder GTPBP3, zwei Proteinen, die voraussichtlich gemeinsam die Addition der τm5S2U34-Modifikation katalysieren, die Empfindlichkeit ihrer mt-tRNAs-Substrate (mt-tRNAs, die für Lys, Glu, Gln, Leu(UUR) kodieren) erhöht ) und Trp) zur Angiogenin-Verdauung35,36,47. Darüber hinaus zeigten unsere Ergebnisse, dass mt-ELP3 physikalisch mit GTPBP3 interagiert. Daher schließen wir, dass mt-ELP3 eine Rolle bei der Biogenese der τm5S2U-Modifikation dieser mt-tRNAs spielt.

Unsere Daten deuten auch darauf hin, dass mt-ELP3 die Thiolmodifikation an Position 2 nicht kontrolliert, da die Überexpression von mt-ELP3 den Thiolierungsstatus dieser mt-tRNAs nicht beeinflusst. Diese Daten zeigen weiterhin, dass die Thiolierung an Position 2 (S2U34) unabhängig von der Modifikation an Position 5 (τm5U34)35,44 ist. Wie oben erwähnt, katalysieren MTO1 und GTPBP3 kooperativ die τm5U34-Modifikation, da ein Defekt in diesen Proteinen direkt zu einer mangelhaften τm5U34-Modifikation ihrer mt-tRNA-Substrate führt. Asano et al. (2018) zeigten, dass die Bildung von τm5U34 beim Versuch, τm5U34 in vitro mit dem GTPBP3-MTO1-Komplex, Taurin, 5,10-CH2-THF, GTP und Co-Faktoren zu rekonstituieren, nur eine Effizienz von 3,3 % aufwies, was darauf hindeutet, dass ein nicht charakterisierter Zustand vorliegt Protein ist für eine effiziente τm5U34-Bildung notwendig. Wir schlagen vor, dass mt-ELP3 eine Rolle bei der Biogenese von τm5U34 spielt, und weitere Studien zur Bewertung der Bildung von τm5U34 in Gegenwart von mt-ELP3 sind erforderlich.

Alternativ könnte mt-ELP3 ein nicht charakterisiertes Homolog der τm5S2U34-Modifikation in mt-tRNAs katalysieren. Interessanterweise wurde 5-Carboxymethylaminomethyluridin (cmnm5U) in mt-tRNAs in HeLa-Zellen nachgewiesen, die unter Bedingungen ohne Taurin kultiviert wurden45. cmnm5U ähnelt strukturell τm5S2U34 und kommt in der Wobble-Position einer Untergruppe bakterieller tRNAs sowie in Hefe und Nematoden vor51. Bakterielle MnmE- und MnmG-Proteine ​​(Homologe von GTPBP3-MTO1) verwenden gemeinsam Glycin (anstelle von Taurin) als Substrat für die Synthese der cmnm5U-Modifikation. Homologe von ELP3 sind jedoch in einigen Bakterien und Viren vorhanden, und ihr Vorhandensein fällt mit dem Fehlen von Genen zusammen, die für MnmE und MnmG in diesen Organismen kodieren51,52,53. Da τm5S2U34 im Wesentlichen synthetisiert wird, wenn die Taurinkonzentration hoch ist, lokalisiert sich ELP3 wahrscheinlich in den Mitochondrien und katalysiert unter Stressbedingungen (z. B. niedrige Taurinkonzentrationen) die cmnm5U-Modifikation in mt-tRNAs an ihrer U34-Position.

Interessanterweise ist in Hefen eine ELP3-abhängige tRNA-Modifikation für die Mitochondrienfunktion unter Stressbedingungen notwendig, und Defekte in dieser Modifikation beeinträchtigten die mitochondriale Proteinsynthese, was zu defekten OXPHOS-Komplexen führte54. Während zusätzliche biochemische Studien erforderlich sind, um die mechanistische Rolle von mt-ELP3 bei der Bildung von τm5U34 oder seinem Homologen vollständig zu verstehen, zeigten unsere Daten, dass die KAT-Domäne von mt-ELP3 für die Funktion seiner mt-tRNAs essentiell ist, was durch den Verlust von mt-ELP3 belegt wird. tRNAs schützen vor Angiogenin, wenn eine Mutation in seiner KAT-Domäne eingeführt wird.

Die τm5S2U34-Modifikation spielt eine entscheidende Rolle für die Effizienz und Genauigkeit der mitochondrialen Translation. Tatsächlich führte der durch MTO1 und/oder einen GTPBP3-Defekt verursachte Verlust der τm5U34-Modifikation zu einem mitochondrialen Translationsdefekt und trug erheblich zur mitochondrialen Dysfunktion bei45,55,56. In der vorliegenden Studie wurde ein Anstieg der mitochondrialen Translationsrate in Zellen beobachtet, die mt-ELP3 überexprimieren, was mit unserer vorhergesagten Funktion von mt-ELP3 bei der Katalyse der Bildung von τm5U34 übereinstimmt. Darüber hinaus war die erhöhte mitochondriale Translationsrate mit einem erheblichen Anstieg der Steady-State-Spiegel von OXPHOS-Komplexen verbunden, was zu einem Anstieg der mitochondrialen ATP-Produktion führte.

Eine beeinträchtigte kanonische ELP3-tRNA-Modifikationsaktivität ist mit mehreren Erkrankungen des Menschen verbunden, darunter verschiedenen Krebsarten und neurodegenerativen Erkrankungen18. Für ein vollständiges Verständnis der Rolle von mt-ELP3 bei den klinischen Manifestationen dieser Krankheiten sind Studien zur gewebespezifischen Expression von mt-ELP3 in menschlichen Geweben notwendig. Unsere vorläufigen Daten deuten darauf hin, dass mt-ELP3 im Gehirn sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene exprimiert wird (Abb. S7), aber auch in mehreren anderen Geweben, wenn auch in geringeren Mengen. In Übereinstimmung mit diesen Daten wurde ELP3 in der mitochondrialen Fraktion des Mausgehirns nachgewiesen25, was darauf hindeutet, dass es in diesem Gewebe wichtig ist.

Kurz gesagt, wir präsentieren Beweise dafür, dass ELP3 in Mitochondrien lokalisiert ist und als nicht-kanonisches mt-tRNA-modifizierendes Enzym fungiert. Diese Studie bietet einen Rahmen für weitere Untersuchungen, die mechanistische Einblicke in mt-ELP3 in der mt-tRNA-Modifikationsreaktion und die Beiträge seines Defekts bei neurodegenerativen Erkrankungen klären werden.

Menschliche HEK-293T- und HeLa-Zellen wurden von ATCC erhalten und in Vollmedium gezüchtet: DMEM bzw. EMEM, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) (Gibco) und 1 % Penicillin/Streptomycin (Gibco) bei 37 °C und 5 °C % CO2.

RNA-Proben aus menschlichem Gewebe wurden von Taraka (Clontech) gekauft.

Zur Erzeugung von pcDNA ELP3 und pcDNA mt-ELP3 wurden die entsprechenden ORFs durch PCR amplifiziert und in einen pCDNA4.T0-Vektor mit einem Flag-Tag am N-Terminus kloniert.

Die KAT-Domänenmutante von ELP3 (pcDNA mt-ELP3 mut) wurde durch PCR-basierte Mutagenese unter Verwendung spezifischer Primer erzeugt, die die gewünschte Mutation enthielten, und pcDNA mt-ELP3 wurde als Matrize verwendet. Die Mutation wurde durch Sequenzierung bestätigt (Abbildung S4). Die zur Erzeugung dieser Mutante verwendeten Primer waren wie folgt:

KAT-F, 5′-CAAACTGATGCTGAAATTTAGTAGG -3′;

KAT-R, 5′-CTTTCATGCTGCTGATGGAGGAAGC-3′.

Für das GTPBP3-Plasmid wurde der humanmarkierte ORF-Klon GTPBP3 (NM_001128855) von Origene erworben (Kat.-Nr. RC225798).

Für den Transfektionstest wurden Zellen vorübergehend mit Kontroll-siRNA-Duplex (OriGene #SR30002) und zwei Stealth-siRNAs, die auf ELP3 abzielen (ELP3-siRNA1 (OriGene#SR310519A) und ELP3-siRNA 2 (OriGene#SR310519B)) oder mit pcDNA 4/T0-Derivatplasmid transfiziert exprimiert kanonisches ELP3 (pcDNA 4/T0-ELP3), mt-ELP3 (pcDNA 4/T0-mt-ELP3), mutiertes mt-ELP3 (pcDNA 4/T0-mt-ELP3) oder leeres pcDNA 4/T0 (pcDNA 4/ T0) mit Lipofectamine 3000-Reagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Zellen wurden nach 2 Tagen Transfektion verarbeitet.

Mit dem Flp-In T-REx Core Kit von Invitrogen wurden induzierbare HEK293-Zelllinien erzeugt, die mt-ELP3 exprimieren. Kurz gesagt wurde die für mt-ELP3 kodierende cDNA in den induzierbaren Expressionsvektor pcDNA5/FRT/TO unter Verwendung von pcDNA mt-ELP3 als Matrize subkloniert. Flp-In T-REx-293-Zellen wurden dann mit dem induzierbaren Expressionsvektor pcDNA5/FRT/TO, der die mt-ELP3-cDNA enthielt, und dem pOG44-Vektor, der die Flp-Rekombinase kodiert, unter Verwendung von OptiMEM/Lipofectamine2000 gemäß den Anweisungen des Herstellers co-transfiziert. Nach 48 Stunden Transfektion wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mit selektivem Medium, das 200 mg/ml Hygromycin enthielt, inkubiert. Das selektive Medium wurde in regelmäßigen Abständen gewechselt, bis die gewünschte Zellzahl gewachsen war. Danach wurden die Hygromycin-resistenten Zellen in DMEM gehalten, das 10 % FBS, 5 μg/ml Blasticidin und 250 μg/ml Zeocin enthielt.

Die Expression von mt-ELP3 wurde durch die Zugabe von Tetracyclin (1 ug/ml) zum Kulturmedium für 24 Stunden induziert.

Die vollständige RNA-Isolierung wurde unter Verwendung von Trizol-Reagenz (Invitrogen) gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Ein Mikrogramm RNA wurde mit einem Hochleistungs-cDNA-Reverse-Transkriptions-Kit (Applied Biosystems) in komplementäre DNA umgewandelt und anschließend mit 180 µl H2O verdünnt. Die Genexpression wurde mit einem CFX384 Real Time System (Bio-Rad) und Thermo Scientific Maxima 2 × SYBR Green gemessen. Das amplifizierte PCR-Produkt wurde einer Agarosegelelektrophorese unterzogen, mit der DNA-Leiter verglichen und dann unter einem UV-Transilluminator sichtbar gemacht. Die verwendeten ELP3-Primer sind in Tabelle S1 aufgeführt.

Northern Blot von APM-haltigen Gelen wurde wie beschrieben durchgeführt, um den Thiolierungsstatus von tRNAs57 zu bestimmen. Kurz gesagt, Gesamt-RNA (5 µg) wurde auf einem 15 %igen Polyacrylamidgel mit 7 M Harnstoff und 10 µg/ml APM laufen gelassen und dann auf positiv geladene Nylonmembranen (Roche) übertragen. Die Vorhybridisierungs- und Hybridisierungsschritte wurden mit Dig Easy Hyb (Roche) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Das Vorhandensein von tRNA-Spezies wurde mit spezifischen DIG-markierten synthetischen Oligodesoxynukleotidsonden nachgewiesen (Tabelle S1).

Angiogenin-Nuklease-Empfindlichkeitstests wurden im Wesentlichen wie beschrieben durchgeführt58. Kurz gesagt, 1 µg Gesamt-RNA wurde mit 2,5 µg/ml rekombinantem Angiogenin (ANG) in Puffer (30 mM HEPES, pH 7,4, 30 mM NaCl, 0,01 % BSA) gemischt. Die Mischungen wurden für die angegebene Zeit bei 37 °C inkubiert. Angiogenin wurde durch Zugabe von 5 µl Gel Loading Buffer II (Life Technologies) inaktiviert. Die verdauten RNA-Proben wurden auf 15 % Polyacrylamid, 8 M Harnstoffgelen aufgetrennt und auf positiv geladene Nylonmembranen übertragen. Die RNA wurde mit der Membran vernetzt (60 °C, 1 h) unter Verwendung einer frisch zubereiteten EDC-Vernetzungslösung59,60. Vorhybridisierung und Hybridisierung wurden mit Dig Easy Hyb (Roche) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. tRNA-Spezies wurden mit spezifischen DIG-markierten synthetischen Oligodesoxynukleotidsonden nachgewiesen (Tabelle S1).

BN-PAGE wurde wie beschrieben durchgeführt61. Proben mit 15 µg Protein wurden auf 3–12 % Bis-Tris Novex NativePAGE-Gel (Life Technologies) aufgetrennt. Die relativen Konzentrationen der zusammengesetzten Atmungskomplexe IV wurden durch Western Blot mit folgenden Antikörpern bewertet: Anti-ND1 (Thermo Fisher, 19703-1-AP), Anti-SDHA (Cell Signaling, 5839), Anti-MTCO1 (Thermo Fisher, 459600). ), Anti-ATP5a (Abcam, 11448) und Anti-Cytb (Abclonal, A17966). Meerrettich-Peroxidase-konjugierte Anti-Kaninchen-IgG- (Sigma, A6154) und Anti-Maus-IgG-Antikörper (Sigma, A4416) wurden als Sekundärantikörper verwendet und Proteinsignale wurden mithilfe des ECL-Systems nachgewiesen. Bis-Tris Novex NativePAGE-Gele (3–12 %) wurden mit Coomassie-Protein-Färbelösung (50 % Methanol, 7 % Essigsäure und 0,1 % Coomassie Brilliant Blue R-Färbung) gefärbt.

HEK293T-Zellen wurden durch 5-minütiges Zentrifugieren bei 500 × g gesammelt. Die Zellen wurden in RIPA-Puffer lysiert, und die Homogenate wurden durch Zentrifugation gereinigt und mit dem BCA-Kit (Thermo Scientific) auf Proteinkonzentration analysiert. Proteinlysate wurden auf 4–20 % Gradientengelen aufgetrennt und auf PVDF-Membranen übertragen.

Die subzelluläre Fraktionierung wurde wie beschrieben mit einer geringfügigen Modifikation durchgeführt62. Die Zellen wurden in hypotonischem Puffer (10 mM Hepes, pH 7,9, 10 mM KCl, 0,1 mM EDTA), der Proteaseinhibitoren (0,5 mM PMSF und Proteaseinhibitor Complete (Roche)) enthielt, 30 Minuten lang auf Eis unter Verwendung eines Dounce-Homogenisators vorsichtig homogenisiert bis die überwiegende Mehrheit der Zellen aufgebrochen und die Kerne mit Trypanblau gefärbt waren, und dann 5 Minuten lang bei 4 °C und 800 x g zentrifugiert, um ein Pellet (Kernfraktion) zu erhalten. Der Überstand wurde 10 Minuten lang bei 4 ° C und 15.000 × g zentrifugiert, um eine mitochondriale Fraktion (Pellet) und eine zytosolische Fraktion (Überstand) zu erhalten. Das mitochondriale Pellet wurde gewaschen und in hypotonischem Puffer suspendiert. Proteinkonzentration und Immunblotting wurden wie oben beschrieben durchgeführt. Wo angegeben, wurde die mitochondriale Fraktion mit Proteinase K (0,5–2 mg/ml) in hypotonischem Puffer in Gegenwart steigender Konzentrationen von Digitonin oder Proteinase K mit 0,3 % Triton X-100 15 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Nach 15 Minuten wurde der Verdau durch Zugabe von 5 µL 200 mM PMSF beendet. Die Proben wurden 5 Minuten lang gekocht und mittels Western Blot analysiert.

Zur Immundetektion wurden die folgenden Antikörper verwendet: Anti-ELP3 (Zellsignalisierung, 5728S), Anti-COX IV (Zellsignalisierung, 4850T), Anti-GAPDH (Abcam, AB9484), Anti-HSP60 (Zellsignalisierung, 4870S), Anti -TOM20 (Zellsignalisierung, 42406), Anti-Flag (Sigma, F1804-200UG), Anti-acetyliertes Lysin (Zellsignalisierung, 9441), Anti-GTPBP3 (Invitrogen, PA5-31323) und Anti-VDAC (Zellsignalisierung, 4661).

HeLa-Zellen wurden über Nacht auf Deckgläsern in Platten mit 24 Vertiefungen kultiviert. Nach vorübergehenden Transfektionen wurden die Zellen mit PBS gewaschen, 20 Minuten bei RT mit 4 % Paraformaldehyd-PBS fixiert, mit PBS gewaschen, 15 Minuten mit 0,3 % Triton X-100 in PBS permeabilisiert und erneut mit PBS gewaschen. Nach 30-minütiger Blockierung bei Raumtemperatur (RT) mit einer Lösung, die 2 % BSA und 0,05 % Triton . Nach dem Waschen mit Blockierungslösung wurden die gebundenen Antikörper anschließend gegebenenfalls durch Inkubation von AlexaFluor 594-konjugierten Anti-Kaninchen- (11.012, Invitrogen) und AlexaFluor 488-konjugierten Anti-Maus- (A11001, Invitrogen) Sekundärantikörpern in Blockierungslösung für 1 Stunde nachgewiesen bei RT. Nach der Färbung mit 1 mg/ml DAPI in PBS wurden die Zellen mit einem konfokalen Leica-Mikroskop untersucht.

293HEKT-Zellen wurden mit den angegebenen Plasmiden co-transfiziert. 72 Stunden nach der Transfektion wurden die transfizierten Zellen geerntet und mit IP-Lysepuffer (Thermos Scientific) lysiert. Die Überstände wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 16.000 × g und 4 ° C erhalten. Die Koimmunpräzipitation wurde mit dem Dynabeads Protein G-Immunpräzipitationskit (Life Technologies) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Kurz gesagt, 10 µg Anti-Flag-M2-Antikörper wurden mit Protein-G-Dynabeads 10 Minuten lang bei RT inkubiert. Nach dem Waschen wurde der Antikörper-Dynabeads-Komplex mit 300 µg Proteinlysaten (Überstand) inkubiert (1 Stunde). Nach dem Waschen wurden die Immunkomplexe in 20 µl Elutionspuffer eluiert und durch Immunblotting analysiert. Dynabeads wurden auch mit Anti-Flag-M2-Antikörper (ohne Lysate) und mit Lysaten (ohne Anti-Flag-M2-Antikörper) inkubiert und als Negativkontrolle verwendet.

Die De-novo-Synthese mitochondrialer Proteine ​​wurde wie beschrieben durchgeführt48. HEK239T-Zellen wurden in Lab-Tek-Kammerobjektträgern (ThermoFisher Scientific) ausgesät und mit pcDNA-T0 oder mit Flag markiertem pcDNA-mt-ELP3 transfiziert. Nach der Transfektion wurden die Zellen 30 Minuten lang in methioninfreiem DMEM inkubiert. Anschließend wurde das Medium durch methioninfreies DMEM mit dem Methioninanalogon L-Homopropargylglycin (HPG) ersetzt und die zytosolische und mitochondriale Translation mit 50 µg/ml Cycloheximid (CHX) bzw. 100 µg/ml Chloramphenicol (CHL) gehemmt. Nach der Markierungsphase wurden die Objektträger sofort auf Eis gelegt und die Zellen wurden mit 0,005 % Digitonin in Puffer A (10 mM HEPES/KOH, 10 mM NaCl, 5 mM MgCl2 und 300 mM Saccharose in H20, pH 7,5) für 2 vorpermeabilisiert Min. bei RT vor der Fixierung in vorgewärmtem 8 % Formaldehyd in Puffer A für 15 Min. Anschließend wurden die Zellen mit 0,5 % Triton X-100 in PBS vollständig permeabilisiert. Pulsmarkierte mitochondriale Proteine ​​wurden mit einer kupferkatalysierten Azid-Alkin-Cycloaddition (600 mM Kupfersulfat, 1,2 mM BTTAA, 40 µM Picolyl Alexa Fluor 594 (CLK-1296-1) Azid und 2 mM Natriumascorbat in PBS) von a nachgewiesen Click-Chemie-Reaktion für 1 Stunde bei RT.

Die Proben wurden mit dem konfokalen Mikroskop LSM700 abgebildet. Nach der Bildgebung wurde jede HPG-gefärbte Zelle durch Zeichnen eines Umrisses nahe der sichtbaren Kante ausgewählt. Anschließend wurde die mittlere Pixelintensität für jeden begrenzten Bereich berechnet, der die Zelle darstellt. Auswahl und Analyse wurden mit maßgeschneiderter, in Python geschriebener Software durchgeführt.

Für die mittels Durchflusszytometrie gemessene Fluoreszenzintensität wurde der Klickreaktion auch Brilliant Violet 421™ Anti-DYKDDDDK (Flag-Tag)-Antikörper (Kat.-Nr. 637322, BioLegend) in einer Verdünnung von 1:50 zugesetzt, um transfizierte Zellen, die mt-ELP3 exprimieren, zu sortieren. Die Zellen wurden dann mit 1XPBS gewaschen und in 100 µl 1xPBS resuspendiert, um sie auf einem Durchflusszytometer zu erfassen. Die Zellen wurden auf FACS Aria II (BD Biosciences) erfasst, wobei das HPG-Signal im Cherry-Filter gesammelt wurde, während das Flag im BV421-Filter gesammelt wurde. Die fcs-Dateien nach der Erfassung wurden mit der Software Flow jo v10 (BD Biosciences) analysiert. Die Zellen wurden als bimodale Verteilung von Cherry (HPG) vs. BV421 (Flag) aufgetragen, der MFI (mittlere Fluoreszenzintensität) von HPG wurde anhand der Flag +- und Flag--Population quantifiziert.

Die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) wurde mit einem Seahorse XF96-Analysator bewertet.

Die Zellen wurden in Seahorse mM Glucose, 1 mM Pyruvat und 4 mM Glutamin, pH 7,4) vor der Analyse. Die bioenergetische Profilierung erfolgte durch Überwachung des Sauerstoffverbrauchs auf Grundniveau, gefolgt von der sequentiellen Injektion der folgenden Inhibitoren: 2 µM Oligomycin, 0,5 µM Carbonylcyanid-4-(trifluormethoxy)-phenylhydrazon, 4 µM Antimycin und 4 µM Myxothiazol. Alle Messungen wurden anhand der Bildgebung gefärbter Kerne auf die Gesamtzahl der Zellen in jeder Vertiefung normalisiert.

Drei unabhängige biologische Experimente (mit zusätzlichen technischen Replikaten) von HEK 293T-Zellen-Kontrollzellen (-Tetra) und Zellen, die mitochondriales ELP3 (+Tetra) überexprimieren, wurden durch Acetyl-Anreicherung und anschließende massenspektrometrische Analyse untersucht. Zelllysate wurden in Lysepuffer eingetaucht, der 8 M Harnstoff, 200 mM Triethylammoniumbicarbonat (TEAB), pH 8,5, 75 mM Natriumchlorid, 1 µM Trichostatin A, 3 mM Nicotinamid und 1 × Protease/Phosphatase-Inhibitor-Cocktail (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) und für 2 Zyklen mit einem Bead Beater TissueLyser II (Qiagen, Germantown, MD) bei 24 Hz für jeweils 3 Minuten homogenisiert. Die Lysate wurden durch 15-minütiges Zentrifugieren bei 15.700 × g und 4 °C geklärt und der Überstand mit den löslichen Proteinen gesammelt. Die Proteinkonzentrationen wurden mit einem Bicinchoninsäure-Protein (BCA)-Assay (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) bestimmt und anschließend wurden 1–2 mg Protein aus jeder Probe mit einer Lösung von 8 M Harnstoff in 50 mM auf ein gleiches Volumen gebracht TEAB, pH 8. Proteine ​​wurden unter Verwendung von 20 mM Dithiothreitol (DTT) in 50 mM TEAB 30 Minuten lang bei 37 °C reduziert und nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur 30 Minuten lang mit 40 mM Iodacetamid (IAA) in 50 mM TEAB alkyliert Raumtemperatur im Dunkeln. Die Proben wurden mit 50 mM TEAB, pH 7,5, vierfach verdünnt und die Proteine ​​über Nacht mit einer Lösung von Trypsin in Sequenzierungsqualität (Promega, San Luis Obispo, CA) in 50 mM TEAB bei einem Enzymverhältnis von 1:50 (Gew.:Gew.) verdaut: Proteinverhältnis bei 37 °C. Diese Reaktion wurde mit 1 % Ameisensäure (FA) gelöscht und die Probe durch 10-minütige Zentrifugation bei 2000 x g bei Raumtemperatur geklärt. Geklärte Peptidproben wurden mit Oasis 10-mg-Sorptionsmittelkartuschen (Waters, Milford, MA) entsalzt und anschließend wurden alle entsalzten Proben vakuumgetrocknet. Die Verdauungen wurden in 1,4 ml Immunaffinitätsreinigungspuffer (IAP) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) resuspendiert, der 50 mM 4-Morpholinpropansulfonsäure (MOPS)/Natriumhydroxid, pH 7,2, 10 mM Dinatriumphosphat und 50 mM enthielt Natriumchlorid zur PTM-Anreicherung. Die Peptide wurden zur Acetylierung mit an Agarosekügelchen konjugierten Anti-Acetyl-Antikörpern angereichert (Acetyl-Lysine Motif Kit; Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Dieser Vorgang wurde gemäß dem Herstellerprotokoll durchgeführt und jede Probe wurde über Nacht mit einem halben Fläschchen gewaschener Perlen inkubiert. Schließlich wurden mit Acetyl angereicherte Peptide mit 0,1 % Trifluoressigsäure in Wasser aus den Antikörper-Kügelchen-Konjugaten eluiert und unter Verwendung von C-18-Zip-Spitzen (Millipore, Billerica, MA) entsalzt. Die Proben wurden vakuumgetrocknet und in 0,2 % FA in Wasser resuspendiert.

Die Proben wurden durch Umkehrphasen-HPLC-ESI-MS/MS unter Verwendung eines Eksigent Ultra Plus nano-LC 2D HPLC-Systems (Dublin, CA) mit einem cHiPLC-System (Eksigent) analysiert, das direkt mit einem Quadrupol-Time-of-Flight verbunden war ( QqTOF) TripleTOF 6600 (oder TripleTOF 5600) Massenspektrometer (SCIEX, Concord, CAN). Nach der Injektion wurden die Peptidmischungen auf einen C18-Vorsäulenchip (200 µm × 0,4 mm ChromXP C18-CL-Chip, 3 µm, 120 Å, SCIEX) geladen und 10 Minuten lang mit 1–2 µl/min mit dem Ladelösungsmittel gewaschen (H2O/0,1 % Ameisensäure) zum Entsalzen. Anschließend wurden die Peptide auf den 75 µm × 15 cm großen ChromXP C18-CL-Chip, 3 µm, 120 Å, (SCIEX) übertragen und mit einer Flussrate von 300 nL/min mit 2–3-stündigen Gradienten unter Verwendung von wässriger Lösung (A ) und Acetonitril (B) Lösungsmittelpuffer.

Identifizierung acetylierter Peptide und Aufbau von Spektralbibliotheken. Jeder Zyklus bestand aus einem 250 ms langen Vorläuferionen-Scan, gefolgt von der Isolierung der 30 am häufigsten vorkommenden Vorläuferionen zwischen 400 und 1500 m/z (Tandem-Massenspektren-Akkumulierungszeit von 100 ms, was eine Gesamtzykluszeit von 3,25 s ergibt; Produkt mit „hoher Empfindlichkeit“) Ionenscanmodus, Software: Analyst 1.7; Build 96) wie zuvor beschrieben63.

Quantifizierung der PTM-angereicherten Peptide mit dem Massenspektrometer TripleTOF 6600. Jeder Zyklus bestand aus einem 250 ms langen Vorläuferionenscan mit einem Massenbereich von 400–1250 m/z. Anschließend werden Fenster mit variabler Breite in inkrementellen Schritten über den gesamten Massenbereich (m/z 400–1250) durchlaufen. Die Zykluszeit von 3,2 s umfasst den 250 ms langen Vorläuferionenscan, gefolgt von einer 45 ms langen Akkumulierungszeit für jedes der variablen 64 DIA-Segmente (Variable Windows Isolation Scheme64), die Fragmentionenmassen zwischen 100 und 1500 m/z überwachen.

Massenspektrometrische datenabhängige Erfassungen (DDA) wurden mit der Datenbanksuchmaschine ProteinPilot (SCIEX Beta 4.5, Revision 1656) unter Verwendung des Paragon-Algorithmus (4.5.0.0, 1654) analysiert. Mithilfe dieser Datenbanksuchmaschinenergebnisse wurden MS/MS-Spektralbibliotheken erstellt. Die Quantifizierung wurde in Skyline unter Verwendung von MS1-Filterung und DIA/SWATH-MS2-Datenquantifizierung (unter Verwendung von XICs von 6–10 MS/MS-Fragmentionen, typischerweise y- und b-Ionen, passend zu spezifischen Peptiden, die in den Spektralbibliotheken vorhanden sind) durchgeführt, wie zuvor beschrieben65, 66,67.

Die statistischen Analysen wurden mit Graph Pad Prism 9 durchgeführt. Bei allen Datenvergleichen wurde der Student-T-Test verwendet. Die statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den Mittelwerten wurden durch Sternchen (*p < 0,05, **p < 0,01 oder ***p < 0,001) und nicht signifikante Unterschiede durch ns angegeben

Die massenspektrometrischen Rohdaten sind unter ftp://massive.ucsd.edu mit der MassIVE-ID MSV000088668 (Passwort Winter) hinterlegt: Gehen Sie zu http://massive.ucsd.edu/ProteoSAFe/status.jsp?task=3b6b233db1d44e65aee8956d17eb7289. Geben Sie den Benutzernamen und das Passwort in der oberen rechten Ecke der Seite ein: Benutzername: MSV000088668_reviewer; Passwort: winter Die Rohdaten sind auch bei ProteomeX unter der ID PXD030850 verfügbar (werden bei Veröffentlichung öffentlich sein).

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Dieses Projekt wurde vom Buck Institute for Research on Aging unterstützt. Wir bedanken uns für die Unterstützung der Instrumentierung für das TripleTOF 6600-System durch den NCRR Shared Instrumentation Grant 1S10 OD016281 (Buck Institute). Wir danken Gary Howard für die Bearbeitung des Manuskripts und John CW Carroll für seine Hilfe bei den Abbildungen und Grafiken.

Buck Institute for Research on Aging, 8001 Redwood Boulevard, Novato, CA, 94945, USA

Rachid Boutoual, Indra Heckenbach, Ritesh Tiwari, Herbert Kasler, Chad A. Lerner, Samah Shah und Eric Verdin

Gladstone Institutes und University of California, San Francisco, San Francisco, CA, 94158, USA

Hyunsun Jo, Vincenzo Calvanese und Eric Verdin

Zentrum für gesundes Altern, Abteilung für Zelluläre und Molekulare Medizin, Universität Kopenhagen, Kopenhagen, Dänemark

Indra Heckenbach und Morten Scheibye-Knudsen

Amgen Research, Amgen Inc., South San Francisco, CA, 94080, USA

Matthew J. Rardin

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Konzeptualisierung, RB und EV; Methodik, RB und EV; Untersuchung, RB (alle Experimente), HJ (bioinformatische Analyse), IH und MSK (IF-Bildgebung und -Analyse), RT und HK (Durchflusszytometrie-Analyse), CAL (Seepferdchen-Analyse), SS, BS und MJR (Proteomik-Analysen), HJ und VC (Konstruktion und Reinigung rekombinanter Proteine). Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Rachid Boutoual oder Eric Verdin.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Eingegangen: 08. April 2022

Angenommen: 05. August 2022

Veröffentlicht: 31. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-18114-x

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