Miniaturisierte QuEChERS-Extraktionsmethode zum Nachweis von Multi

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 7164 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Der Verlust und die Fragmentierung von Lebensräumen gehören zu den größten Bedrohungen für die biologische Vielfalt und die Stabilität des Ökosystems und haben physiologische Auswirkungen auf die wildlebende Fauna. Fledermäuse (Microchiroptera) sind kleine Säugetiere mit vielfältigen Essgewohnheiten, deren Wohlbefinden durch die Einwirkung von Pestiziden beeinträchtigt wird. Ziel dieser Studie war die Entwicklung einer miniaturisierten QuEChERS-Extraktionsmethode (Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and Safe) zum Nachweis von Pestiziden mit mehreren Rückständen im Muskelgewebe von Fledermäusen mittels Gaschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie (GC-MS). Insgesamt wurden 48 Pestizide in 250 mg Fledermausmuskelgewebe getestet. Die entwickelte Analysemethode wurde auf 148 Fledermäuse angewendet, die aus zwei verschiedenen Gebieten im Bundesstaat Minas Gerais im Südosten Brasiliens gesammelt wurden. Die Methode zeigte eine gute Empfindlichkeit und ermöglichte die Bestimmung von Rückständen von 48 Pestiziden im Fledermausmuskel mittels GC-MS. Die miniaturisierte Extraktionsmethode macht die Analyse auch bei begrenztem Probenvolumen möglich. Bei Fledermäusen aus den beiden untersuchten Gebieten wurden jedoch keine Pestizidrückstände nachgewiesen.

Umweltverschmutzung durch Pestizide hat sowohl direkte als auch indirekte Auswirkungen auf Ökosysteme1,2. Zu diesen Auswirkungen gehören ein Rückgang der Artenvielfalt3,4 und ein Rückgang der Population mehrerer Arten, darunter Fledermäuse2,5,6,7, Vögel8 und Amphibien9,10. Die Bestimmung der Umweltbelastung durch Pestizide kann eine toxikologische Risikobewertung der bewerteten Arten ermöglichen. Die Exposition von Tieren gegenüber Pestiziden kann durch die Bestimmung des Pestizidrückstands in Geweben beurteilt werden, üblicherweise durch Gaschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie (GC-MS), was die Trennung und den Nachweis einer Mischung von Komponenten mit hoher analytischer Empfindlichkeit ermöglicht11,12. Aufgrund der komplexen Beschaffenheit der Proben und der geringen Pestizidkonzentrationen bei Tieren mit geringer Körpermasse ist es von entscheidender Bedeutung, die interessierenden Analyten während der Probenvorbereitung zu extrahieren und zu konzentrieren und gleichzeitig mögliche Störstoffe zu entfernen13.

Die Quick, Easy, Cheap, Effective, Rugged, and Safe (QuEChERS)-Extraktionsmethode wurde als einfache Multirückstandsmethode entwickelt, die in jedem Labor durchgeführt werden kann, ohne dass eine hochentwickelte Ausrüstung erforderlich ist14. Diese Methode wurde ursprünglich für die Extraktion von Pestizidrückständen aus pflanzlichen Matrizen vorgeschlagen; Aufgrund seiner Einfachheit und Wirksamkeit wurde es jedoch für die Verwendung in anderen Arten von Matrizen angepasst und optimiert, darunter tierische Gewebe15,16, Milch17, Honig18,19,20, Wasser21,22 und Erde23,24.

Die ursprüngliche QuEChERS-Methode erfordert 10 g Probe14, was für kleinere Probengrößen nicht immer verfügbar ist. Daher ist die Miniaturisierung von QuEChERS eine alternative Technik zur Analyse kleiner Proben25,26,27. Darüber hinaus verbraucht die miniaturisierte Methode weniger Reagenzien und Lösungsmittel, ist relativ kostengünstiger und verringert die Umweltbelastung im Vergleich zu herkömmlichen Methoden28.

Fledermäuse (Microchiroptera) sind kleine Säugetiere mit vielfältigen Essgewohnheiten; Daher spielen sie eine wichtige Ökosystemleistung bei der Erhaltung von Biomen durch Samenverbreitung, Bestäubung und die Kontrolle von Insekten- und kleinen Wirbeltierpopulationen29. Die ersten Berichte über die Sterblichkeit von Fledermäusen durch Pestizide wurden in den frühen 1950er Jahren veröffentlicht30,31. Andere Studien haben über die Exposition von Fledermäusen gegenüber Pestiziden, vor allem Organochlor, durch die Bestimmung von Rückständen und deren Auswirkungen sowie die Bestimmung tödlicher Dosen und Konzentrationen der Pestizide berichtet2. In letzter Zeit besteht ein erhöhtes Interesse an der Bewertung der Auswirkungen einer längeren Exposition gegenüber Pestiziden2 auf lebende Organismen. Allerdings gibt es nach wie vor nur wenige Bewertungen natürlicher Populationen32,33.

Die Bestimmung von Pestizidrückständen ist bei den meisten Fledermausarten aufgrund ihrer geringen Körpermasse eine Herausforderung: Einzelne Tiere können weniger als 10 g wiegen34. Ziel dieser Studie war daher die Entwicklung einer miniaturisierten QuEChERS-Extraktionsmethode zum Nachweis von Pestiziden mit mehreren Rückständen im Muskelgewebe von Fledermäusen mittels GC-MS. Die entwickelte Methode verwendet weniger Reagenzien und weniger Fledermausgewebe als herkömmliche Techniken.

Reagenzien in Analysequalität für die Analyse mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC), einschließlich Acetonitril (JT Baker, Mexiko), Ethylacetat (JT Baker, Mexiko), Hexan (Merck, Darmstadt, Deutschland), primäre und sekundäre Amine (PSA; Agilent, In dieser Studie wurden Octadecylsilan (C18; Agilent, Santa Clara, CA, USA), Magnesiumsulfat (St. Louis, MO, USA) und Aceton (Scharlau, Barcelona, Spanien) verwendet. Reinstwasser wurde unter Verwendung eines Millipore Q UV3-Reinigungssystems (Merck, Milford, CT, USA) erhalten. Analytische Standards der untersuchten Pestizide wurden von Dr. Ehrenstorfer (Augsburg, Deutschland) und AccuStandard (New Haven, CT, USA) bereitgestellt (> 98,0 % Reinheitsgrad).

Das Versuchsdesign und die Tiersammlung wurden von der Ethikkommission für die Verwendung von Tieren der Bundesuniversität Minas Gerais (Protokoll CEUA 166/2017) und dem Chico Mendes Institute for Conservation and Biodiversity (Protokoll ICMBio 57.026-1) genehmigt.

Für die Fledermaussammlung wurden zwei Gebiete mit unterschiedlichen anthropischen Belastungen ausgewählt: eines in einem ländlichen Gebiet der Gemeinde Uberaba, MG, Brasilien (19°45′43'' S' und 48°06′05'' W), das durch intensive Landwirtschaft gekennzeichnet ist Aktivität35 und die andere im Nationalpark (PARNA) von Serra do Cipó, Santana do Riacho, MG, Brasilien, einer brasilianischen Bundesschutzeinheit36. Die Fledermäuse wurden in den Jahren 2018 und 2019 mit 10–12 m langen Fangnetzen eingesammelt, die in der Abenddämmerung auf Wegen, Waldstücken und in der Nähe von Tagesunterkünften geöffnet wurden. Die Nebelnetze blieben etwa 4 Stunden (18:00–22:00 Uhr) geöffnet und wurden in Abständen von 20–30 Minuten überprüft. Die Fangverfahren wurden in Übereinstimmung mit der American Society of Mammalogists37 durchgeführt. Insgesamt wurden 148 Fledermäuse gesammelt: 78 aus der Agrarregion Uberaba und 70 aus der Bundesschutzeinheit PARNA. Die Tiere wurden bis zur Euthanasie in einzelne Stoffbeutel gesteckt. Anschließend wurden die Tiere in einen Plastikbeutel mit einem Wattepad gesteckt, der zuvor in Isofluran getaucht wurde, um Bewusstlosigkeit herbeizuführen, gefolgt von einer intraperitonealen Injektion eines Anästhetikums (Ketaminhydrochlorid). Anschließend wurden die Fledermäuse bis zur Analyse in einem Gefrierschrank bei –20 °C gelagert.

Die Auswahl der Gewebe für die chromatographische Analyse basierte auf früheren Studien, die darauf hindeuteten, dass in Leber-, Fett- und Muskelgeweben höhere Konzentrationen an Pestiziden und anderen xenobiotischen Rückständen zu finden sind38,39,40. Da Fledermäuse wenig Fett haben, wurde Muskel aufgrund seines großen Vorkommens als Matrix verwendet41. Da die Leber jedoch für eine Analyse nicht ausreichte, insbesondere bei kleineren Arten, wurden Fett- und Leberfragmente größerer Fledermäuse gesammelt, um eine vergleichende Analyse verschiedener Gewebetypen durchzuführen.

Es wurden zwei Extraktionsmethoden mit 1,0 g (Methode A) und 250 mg (Methode B) Fledermausmuskelgewebe verglichen.

Methode A basiert auf einer modifizierten QuEChERS-Extraktionsmethode, die von Oliveira et al.15 beschrieben wurde. Wasser (3,6 ml), Acetonitril (5,0 ml) und Ethylacetat (2,14 ml) wurden zu 1,0 g Probe gegeben und die Mischung 1 Minute lang bei 2200 U/min gevortext. Es folgte die Zugabe von MgSO4 (2,86 mg) und Natriumacetat (0,71 mg), die dann im Vortex 1 Minute lang bei 2200 U/min homogenisiert und 11 Minuten lang bei 4000 U/min zentrifugiert wurden. Anschließend wurden die Proben über Nacht bei –20 °C aufbewahrt. Anschließend wurden die Proben 5 Minuten lang bei 4000 U/min zentrifugiert und der Extrakt (1,0 ml) anschließend in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit MgSO4 (150 mg), PSA (30 mg) und C18 (30 mg) überführt. Nach Rühren bei Raumtemperatur (1 Minute lang bei 2200 U/min) und Zentrifugation (12 Minuten lang bei 9000 U/min) wurde der Überstand in das GC-MS-Gerät injiziert.

Methode B basiert auf der von Brandhonneur et al.25 vorgeschlagenen miniaturisierten QuEChERS-Extraktionsmethode. Die Proben wurden aufgetaut und Fragmente des Brustmuskels (250 mg) wurden entnommen, dehydriert und mit MgSO4 (400 mg) homogenisiert. Zu jeder Probe wurden Acetonitril (1,4 ml), Hexan (200 µL) und Azoxystrobin (1,2 ng/ml, zur Prozesskontrolle) hinzugefügt. Die Proben wurden 5 Minuten lang bei 2200 U/min gevortext und 30 Minuten lang in einen Gefrierschrank bei –20 °C gestellt. Anschließend wurden die Proben 20 Minuten lang bei 5000 U/min zentrifugiert. Als nächstes wurde die organische Phase (800 µL) in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit MgSO4 (100 mg), PSA (50 mg) und C18 (50 mg) überführt. Nach 1-minütigem Vortexen bei 2200 U/min wurden die Proben 10 Minuten lang bei Raumtemperatur auf einen Schüttler gestellt und anschließend 12 Minuten lang bei 12.000 U/min und 10 °C zentrifugiert. Die organische Phase (150 µL) wurde in ein Fläschchen überführt, das mit einem Einsatz ausgestattet war, um das Lösungsmittel bei Raumtemperatur zu verdampfen. Die Proben wurden mit Aceton (75 µL) rekonstituiert, 30 Sekunden lang bei 2200 U/min gevortext und die Lösung (8 µL) wurde dann in das GC-MS-Gerät injiziert.

Als Prozesskontrolle wurde Azoxystrobin (Chargenstandard G128076 von Dr. Ehrenstorfer, Deutschland) in Acetonitril (1,2 ng/ml) verwendet. Alle Proben, einschließlich der weißen Proben (nicht dotierte Proben), wurden mit 440 µL Azoxystrobin (1,2 ng/ml) angereichert. Die Extraktion wurde als zufriedenstellend angesehen, wenn die Azoxystrobin-Rückgewinnungsrate zwischen 80 und 110 % schwankte42.

Nach der Bestimmung der besten Extraktionsmethode (A oder B) wurde das Fledermausmuskelfragment mit einer Pestizid-Stammlösung angereichert und extrahiert, um die Retentionszeit (RT) und die Ionen für die Chromatographie im ausgewählten Ionenüberwachungsmodus (SIM) zu bestimmen.

Chromatografische Analysen wurden mit einem GC-MS-Gerät (Agilent 7890A-5975C) durchgeführt, das mit einem automatischen Probengeber (Agilent Sampler 80) ausgestattet war. Die chromatographische Trennung wurde unter Verwendung einer Kapillarsäule DB-5 (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm; Agilent Technologies, USA) mit He (99,999 %; Air Products, Brasilien) als Trägergas bei einer Flussrate von 1,2 ml/min durchgeführt . Die chromatographischen Bedingungen umfassten eine Injektortemperatur von 250 °C, ein Injektionsvolumen von 8 µL im Splitless-Modus, einen Säulentemperaturanstieg von 60 auf 160 °C mit drei Heizratenrampen von 20 °C/min, gefolgt von einem Anstieg auf 255 °C C bei 5 °C/Min. und dann ein Anstieg von 20 °C/Min. bis zu einer Endtemperatur von 280 °C, die 7 Min. aufrechterhalten wurde. Die Nachlaufzeit betrug 2 Minuten bei 280 °C und einer He-Flussrate von 2,6 ml/Minute. Die gesamte chromatographische Laufzeit betrug 32,25 Minuten. Die Injektionsspritze wurde zwischen den Injektionen dreimal mit Aceton-Wasser (1:1 v/v) und Acetonitril gewaschen. Das Spektrometer wurde auf eine Stoßionisationsspannung von 70 eV, eine Ionisationsquellentemperatur von 230 °C, eine Quadrupoltemperatur von 150 °C und eine Grenzflächentemperatur von 300 °C eingestellt.

Die für die Datenerfassung verwendete Software war die MSD ChemStation. Die Datenerfassung begann im Full-Scan-Modus nach 3,5 Minuten, mit einem Massenbereich zwischen 50 und 450 m/z im SIM-Modus. Die Pestizide wurden durch einen Vergleich der Ergebnisse mit den Daten aus der Bibliotheksdatenbank des National Institute of Standards and Technology (NIST) bestätigt. Der SIM-Modus wurde zur Identifizierung von Verbindungen in Standardlösungen verwendet. Die überwachten Ionen und RTs sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Es wurde eine Standard-Stammlösung mit 69 Pestiziden verwendet. Eintausend Mikroliter der Stammlösung in Acetonitril-Ethylacetat (7:3 v/v) wurden in das GC-MS-Gerät injiziert. Die Arbeitslösungen der einzelnen Pestizide sind in Tabelle 2 aufgeführt.

Zunächst wurde 1 µL Pestizidstandards in Acetonitrilacetat mit einem Splitless-Liner bei einer Injektortemperatur von 250 °C und Trägergas mit einer Flussrate zwischen 1,0 und 1,2 ml/min injiziert.

Es wurden vier Ofentemperaturrampenbedingungen angewendet, um die optimalen Bedingungen für eine bessere analytische Empfindlichkeit zu bestimmen, wie unten beschrieben.

Bedingung 1: Eine anfängliche Säulentemperatur von 80 °C, gefolgt von einer Aufheizrate von 20 °C/min bis 160 °C, einem Anstieg auf 255 °C mit 5 °C/min und einem Anstieg von 20 °C/min. min auf eine Endtemperatur von 280 °C erhitzt, die 1 min lang gehalten wurde. Die Gesamtlaufzeit betrug 25,25 Minuten.

Bedingung 2 (angepasst von Maštovská et al.43): Eine anfängliche Säulentemperatur von 80 °C, die 1,5 Minuten lang gehalten wird, gefolgt von einer Aufheizrampe von 20 °C/Minute bis 180 °C, einem Anstieg auf 230 °C bei 5 °C/min und eine Rampe von 25 °C/min, bis eine Endtemperatur von 290 °C erreicht wurde, die 10 min lang aufrechterhalten wurde. Die Gesamtlaufzeit betrug 28,9 Minuten.

Bedingung 3 (angepasst von Faria et al.44): Der Säulentemperaturanstieg begann bei 60 °C und wurde 1 Minute lang beibehalten, gefolgt von einer Aufheizrate von 30 °C/Minute bis 180 °C, was einem Anstieg auf 300 entspricht °C mit 5 °C/min und einem Anstieg von 50 °C/min bis zu einer Endtemperatur von 325 °C, die 2 min lang aufrechterhalten wurde. Die Gesamtlaufzeit betrug 29,5 Minuten.

Bedingung 4 (angepasst von Valenzuela et al.45): Eine anfängliche Säulentemperatur von 60 °C, gefolgt von einer Aufheizrate von 20 °C/min bis 160 °C, einem Anstieg auf 255 °C mit 5 °C/min und eine Rampe von 20 °C/min auf eine Endtemperatur von 280 °C, die 7 Minuten lang aufrechterhalten wurde. Die Gesamtlaufzeit betrug 32,25 Minuten.

Temperaturrampen wurden mit Injektionsvolumina von 2, 5 und 8 µL optimiert. Die Bewertung des Pestizidabbaus im Injektionssystem wurde bei Injektortemperaturen von 100, 150, 200 und 250 °C durchgeführt.

Die Nachweisgrenze (DL) wurde durch Multiplikation der Standardabweichung (SD) mit drei46 berechnet. Die SD wurde durch die Beurteilung von 10 weißen Proben (nur Extrakte aus Fledermausmuskeln) und die Aufzeichnung der Häufigkeit entsprechend der RT jedes Pestizids ermittelt. Eine in PARNA Serra do Cipó gefangene Fledermaus wurde ausschließlich zur Berechnung des DL verwendet. Die Probe stammte aus dem Referenzgebiet; Daher waren hohe Konzentrationen an Pestizidrückständen nicht zu erwarten. Außerdem wurde ein größerer Schläger gewählt, da dieser über mehr Muskelgewebe verfügt. Folglich wurden 10 Extrakte für die Messungen und Berechnung der SD erstellt. Bei den erhaltenen Werten waren nur geringe Schwankungen zu erwarten, da die Proben von derselben Person stammten; Die Abweichungen wurden auf die Einschränkungen des Instruments und der Extraktionsmethoden zurückgeführt.

Nach der Bestimmung der besten Extraktionsmethode wurde die Ausbeute berechnet, um die möglichen Verluste zu berücksichtigen, die während des Analyseprozesses auftraten47,48. Es wurden zwei Fledermausmuskelfragmente einer in PARNA Serra do Cipó gefangenen Fledermaus verwendet. Ein Fragment wurde vor der Extraktion mit einer Pestizid-Stammlösung von Standards angereichert, die 69 Pestizide enthielt, und das andere wurde nach der Extraktion angereichert. Anschließend wurden beide Fragmente chromatographischen Läufen unterzogen, um die Analyten und die geschätzten Wiederfindungswerte zu bestimmen. Die Wiederfindung gibt die Menge des nachgewiesenen Analyten im Verhältnis zur zur Probe hinzugefügten Menge an. Schwankungen der Werte können aufgrund von Matrixeffekten und Verlust von Analyten aufgrund einer Verschlechterung des Injektionssystems oder des Extraktionsverfahrens (Reinigung, Verdünnung, Trocknung oder Vorkonzentration) auftreten.

Die Umweltverträglichkeit der entwickelten Methode wurde mithilfe der metrischen Systeme Green Analytical Procedure Index (GAPI)49 und Analytical EcoScale (AES)50 bestimmt.

Die Studie wurde gemäß der Deklaration von Helsinki und den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt und von der Ethikkommission für die Verwendung von Tieren an der Bundesuniversität Minas Gerais (Protokoll CEUA 166/2017) und vom Chico Mendes Institute for Conservation and Biodiversity genehmigt ( Protokoll ICMBio 57.026-1). Die Studie wird gemäß berichtet.

Alle Autoren erklärten sich bereit, an der Veröffentlichung mitzuwirken.

Die miniaturisierte QuEChERS-Methode (Methode B) lieferte die optimalen Ergebnisse für die Extraktion, da sie erkennbare Peaks und weniger Rauschen in den Spektren erzeugte. Anschließend wurden die Probenextraktion, die Reinigungsmethode und die chromatographischen Bedingungen optimiert. Es wurden vier Ofentemperaturrampen (Bedingungen 1–4) getestet und die Bedingungen 1 und 4 zeigten die besten Ergebnisse. Diese Bedingungen wurden erneut mit einem Injektionsvolumen von 2 µL getestet. Bedingung 4 wurde gewählt, weil sie weniger Rauschen und eine bessere Peakdefinition aufwies (Abb. 1). Anschließend wurde die gewählte Methode mit Injektionsvolumina von 5 und 8 µL getestet. Ein Injektionsvolumen von 8 µL führte zum Nachweis einer größeren Anzahl von Pestiziden.

Chromatogramm einer leeren Fledermausmuskelprobe, versetzt mit 69 Pestiziden, erhalten durch Gaschromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie (GC-MS) im Vollscan-Modus unter Verwendung von Bedingung 4 (anfängliche Säulentemperatur von 60 °C, gefolgt von einer Heizrate von 20 °C/ min bis 160 °C, ein Anstieg auf 255 °C mit 5 °C/min und ein Anstieg von 20 °C/min auf eine Endtemperatur von 280 °C, die 7 min lang aufrechterhalten wurde; die Gesamtlaufzeit betrug 32,25 Mindest).

Um festzustellen, ob im Injektionssystem ein Pestizidabbau stattfand, wurden auch Injektortemperaturen von 100, 150, 200 und 250 °C getestet.

Zur Datenerfassung wurden mit dieser Methode drei Ionenübergänge für jedes Pestizid bei den jeweiligen RTs erfasst. Die Pestizide wurden durch den Vergleich der im Full-Scan-Modus erhaltenen Massenspektren mit der NIST-Bibliothek51 identifiziert und bestätigt. Zur Bestätigung der Identifizierung des Analyten wurde eine Mindestwahrscheinlichkeit von 70 % zwischen dem im Vollscanmodus erhaltenen Spektrum und der Bibliotheksdatenbank angewendet. Dieser Prozentsatz wurde als ausreichend angesehen, da die Tests unter Verwendung analytischer Standards durchgeführt wurden. Wahrscheinlichkeitsunterschiede wurden durch Vergleich der im Full-Scan- und SIM-Modus erhaltenen Spektren ermittelt. Diese Unterschiede entstehen dadurch, dass im Full-Scan-Modus alle vorhandenen Ionen angezeigt werden können, während im SIM-Modus nur die ausgewählten Ionen angezeigt werden. Im SIM-Spektrum wurde der Analyt durch Schätzung der entsprechenden Peakfläche quantifiziert. Die DL-Schätzungen sind in Tabelle 3 aufgeführt.

Die Wiederfindungswerte lagen zwischen 35,3 und 97,6 %. Nach Angaben der Association of Official Analytical Chemists48 liegt der empfohlene Bereich der Wiederfindungsprozentsätze für Analyten bei einer Konzentration von 1 ppb zwischen 40 und 120 %48. Sieben Pestizide (Trifluralin, HCH alpha, HCH beta, Endosulfan I, Dieldrin, Bifenthrin und Lambda-Cyhalothrin) zeigten Wiederfindungswerte außerhalb des empfohlenen Bereichs (Tabelle 3). Da jedoch die NIST-Bibliothek als Bestätigungsmethode verwendet wurde, zeigten nur Endosulfan I und Lambda-Cyhalothrin keine akzeptable Erholung. Daher lieferte die von uns entwickelte Extraktionsmethode zufriedenstellende Ergebnisse.

Die entwickelte Methode wurde mithilfe von GAPI und AES auf Grünheit hin bewertet. Die Schätzparameter des GAPI sind in Tabelle 4 dargestellt und ein Piktogramm ist in Abb. 2 dargestellt. Für die Grünbewertung mittels AES erreichte die Methode einen Wert von 80 (Tabelle 5), was auf eine ausgezeichnete Grünanalyse hinweist.

Bewertungspiktogramm des Green Analytical Procedure Index (GAPI) der entwickelten Analysemethode.

Im Muskelgewebe von Fledermäusen aus Uberaba und PARNA Serra do Cipó wurden keine Pestizidrückstände oberhalb der DLs festgestellt. Ebenso wurden in den aus der Leber und dem Fettgewebe gewonnenen Extrakten keine Pestizidrückstände festgestellt.

In dieser Studie haben wir eine Methode zur Bestimmung der Rückstände von 48 Pestiziden im Fledermausmuskel mithilfe von GC-MS entwickelt. Eine von Brandhonneur et al.25 adaptierte miniaturisierte QuEChERS-Methode lieferte optimale Ergebnisse, da sie erkennbare Peaks und weniger Grundlinienrauschen lieferte. Durch die Miniaturisierung der Methode ist die Analyse auch bei begrenzter Probenmenge möglich. Darüber hinaus werden weniger Reagenzien als bei herkömmlichen Methoden verwendet, was sowohl die Kosten als auch die Auswirkungen auf die Umwelt und die Gesundheit der Forscher reduziert.

Acetonitril ist eines der am häufigsten verwendeten Extraktionslösungsmittel, da es die Extraktion vieler Pestizide ermöglicht und gleichzeitig die Extraktion von Lipiden, Kohlenhydraten und Proteinen, die in der Matrix vorhanden sind, minimiert52. Lipide sind Verbindungen, die mehr Aufmerksamkeit erfordern, da sie die Qualität der Ergebnisse beeinträchtigen können und sich auch im Injektionssystem oder in der Chromatographiesäule ablagern und das Chromatographiesystem beschädigen können53. Das dem Extraktionsprozess zugesetzte Hexan unterstützt die Entfernung lipophiler Verbindungen, da diese Verbindungen in Acetonitril weniger löslich sind54. Trocknende Salze wie Magnesiumsulfat (MgSO4) und Natriumsulfat (Na2SO4) entfernen Restwasser aus der Lösung und erleichtern die Entfernung polarer Komponenten aus der Matrix14,52,55. In dieser Arbeit haben wir MgSO4 verwendet, da es eine größere Trocknungskraft als Na2SO452 hat. Darüber hinaus kann die bei der chemischen Hydratationsreaktion von MgSO4 freigesetzte Wärme zur Pestizidextraktion beitragen14.

Darüber hinaus verwendeten wir PSA- und C18-Sorptionsmittel, um während der Probenreinigung koextrahierte Störstoffe aus der Matrix zu entfernen14,56,57. PSA hat eine zweizähnige Struktur, die eine chelatbildende Wirkung ausübt, die die Retention von freien Fettsäuren, Kohlenhydraten und anderen polaren Verbindungen in der Matrix ermöglicht14, wohingegen C18 für die Entfernung von Fettsäuren und anderen unpolaren Komponenten wichtig ist56.

Gemäß dem Validierungsleitfaden für Qualitätskontrollmethoden und -verfahren für die Analyse von Pestizidrückständen müssen die Daten für die Gültigkeit der CG-MS-Analyse mit einem einfachen Quadrupol-Massenanalysator im Full-Scan-Verfahren mit begrenztem Bereich erfasst werden von m/z und SIM-Modus-Überwachung von drei Ionen46. Im Vollscan-Modus wurde ein vollständiger Massenscan im Bereich von 50–450 m/z durchgeführt, wodurch ein vollständiges Spektrum erzeugt wurde, das mehr als eine Substanz bei derselben RT enthielt. Dieser Datenerfassungsmodus ist weniger empfindlich, wenn Analyten in geringen Konzentrationen vorhanden sind, wohingegen hohe Konzentrationen von Matrixinterferenzen vorhanden sind58,59. Die Empfindlichkeit und Selektivität der Methode kann im SIM-Modus verbessert werden, bei dem der Massenanalysator so programmiert ist, dass er nur die charakteristischen Ionen der untersuchten Verbindungen überwacht59.

Die entwickelte Methode ermöglichte den Nachweis von 48 Pestiziden mittels GC-MS. Andere Methoden wurden zum Nachweis von Pestiziden bei Fledermäusen eingesetzt32,33. Valdespino und Sosa33 identifizierten außerdem 19 chlororganische Pestizide mittels GC-MS. Stecherts et al.32 analysierten 25 Organochlor-, Organophosphat- und Pyrethroid-Pestizide in Fledermauskadavern mit drei verschiedenen chromatographischen Systemen (GC/ECD, HPLC/DAD und LC/MS/MS). Somit ermöglicht die in dieser Studie beschriebene Methode den Nachweis einer größeren Anzahl von Pestiziden. Darüber hinaus erforderten beide oben genannten Methoden die Verwendung des gesamten Fledermauskadavers, während bei unserer Methode nur 250 mg Fledermausmuskeln zum Einsatz kamen, sodass der Rest des Tieres für andere Analysen verwendet werden konnte, was einen großen Vorteil für zukünftige Studien zur Umwelttoxikologie darstellt.

Frühere Studien untersuchten die Exposition insektenfressender Fledermäuse durch Bestimmung der Rückstände von Organochlor- und Organophosphat-Insektiziden2. Bei Fledermäusen aus Uberaba oder PARNA Serra do Cipó wurden jedoch keine Pestizidrückstände oberhalb der DLs festgestellt. PARNA Serra do Cipó ist eine integral geschützte Naturschutzeinheit, die nicht von intensiven landwirtschaftlichen Aktivitäten umgeben ist36. Im Gegensatz dazu ist Uberaba eine der wichtigsten Gemeinden im Bundesstaat Minas Gerais, die Getreide und Zuckerrohr anbaut35, und der Einsatz von Pestiziden für diese Kulturen ist höher als für andere Kulturen in Brasilien60. Es gibt kaum Literatur zur Umweltverschmutzung durch Pestizide in diesen Gemeinden. Analysen der Wasserversorgung der Stadtbewohner ergaben jedoch eine Verunreinigung durch Alachlor, Atrazin, Carbendazim, Chlordan, DDT, DDD, DDE, Diuron, Glyphosat, Lindan, Mancozeb, Permethrin, Trifluralin, 2,4-D, 2,4, 5-T, Aldicarb, Aldrin, Carbofuran, Chlorpyrifos, Endosulfan, Endrin, Methamidophos, Metalachlor, Molinat, Methylparathion, Pendimenthalin, Profenofos, Simazin, Tebuconazol und Terbufos61. Obwohl keine Pestizidrückstände festgestellt wurden, kann daher davon ausgegangen werden, dass Fledermäuse in Uberaba einer Umweltverschmutzung durch Pestizide ausgesetzt sind, deren Konzentrationen unter den in den DLs definierten Konzentrationen liegen.

Die Grünheit der entwickelten Analysemethode wurde mithilfe von zwei metrischen Systemen geschätzt: GAPI49 und AES50. GAPI ist eine qualitative Analyse, die 15 Parameter misst, die in drei Kategorien unterteilt sind: I, Probenvorbereitung (Sammlung, Konservierung, Transport, Lagerung, Art der Methode, Extraktionsmaßstab, verwendete Lösungsmittel/Reagenzien und zusätzliche Behandlungen); II, Reagenzien und Lösungsmittel (Menge, Gesundheitsrisiko und Sicherheitsrisiko); und III, Instrumentenbewertung (Energieverbrauch, Berufsrisiko, produzierter Abfall und Abfallbehandlung). Jeder Parameter ist entsprechend der geschätzten Umweltauswirkung wie folgt farblich gekennzeichnet: niedrig (grün), mittel (gelb) oder hoch (rot); und die Ergebnisse werden als Piktogramm dargestellt, das aus fünf Fünfecken besteht49,62. Das GAPI-Piktogramm für die hier beschriebene Methode wies eine geringere geschätzte Umweltbelastung auf als die früherer QuEChERS-Methoden63.

In dieser Studie haben wir das AES-Metriksystem50 verwendet, um die Umweltfreundlichkeit der entwickelten Methode zu bewerten. AES basiert auf EcoScale, einer semiquantitativen Analyse zur Messung der ökologischen, sicherheitstechnischen und wirtschaftlichen Auswirkungen organischer Synthesemethoden64. Die AES-Attributwerte für die Analysemethode liegen zwischen 0 und 100. Strafpunkte werden auf der Grundlage der Reagenzienmengen und -gefahren, des Energieverbrauchs, der Gefahren am Arbeitsplatz und des Abfalls berechnet, die dann von der Höchstpunktzahl von 100 abgezogen werden. Für ausgezeichnete umweltfreundliche Analysemethoden gibt es Punkte Werte über 75 und Werte über 50 gelten als akzeptabel50,62. Die in dieser Studie beschriebene Methode erzielte einen Wert von 80, was auf eine hervorragende Grünanalyse hinweist.

Zusammenfassend ermöglichte die in dieser Studie verwendete Analysemethode die Identifizierung von 48 verschiedenen Pestiziden im Fledermausmuskel mittels GC-MS. Bei den 148 untersuchten Fledermäusen aus den beiden verschiedenen Gebieten wurden jedoch keine Pestizidrückstände nachgewiesen.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Diese Forschung wurde von der Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais – FAPEMIG, Fördernummer APQ-01705-18, und dem Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico – CNPq, Fördernummer 311182/2017-8 finanziert.

Abteilung für Veterinärklinik und Chirurgie, Veterinärschule, Bundesuniversität Minas Gerais (UFMG), Belo Horizonte, MG, Brasilien

Camila Guimarães Torquetti & Benito Soto-Blanco

Abteilung für klinische und toxikologische Analyse, Fakultät für Pharmazie, Bundesuniversität Minas Gerais (UFMG), Belo Horizonte, MG, Brasilien

Mirna Maciel d'Auriol-Souza & Leiliane Coelho André

Biologisches Forschungslabor, Zentrum für Bio- und Gesundheitswissenschaften, Staatliche Universität Westparaná (Unioeste), Cascavel, PR, Brasilien

Ana Tereza Bittencourt Guimarães

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Konzeptualisierung: CGT, ATBG, BSB Probensammlung: CGT Analyse: CGT, MMAS, LCA Schreiben, Überprüfen und Bearbeiten: CGT, ATBG, BSB Alle Autoren haben das Manuskript überprüft. Alle Autoren gaben ihr Einverständnis zur Veröffentlichung.

Korrespondenz mit Benito Soto-Blanco.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Guimarães Torquetti, C., Maciel d'Auriol-Souza, M., Coelho André, L. et al. Miniaturisierte QuEChERS-Extraktionsmethode zum Nachweis von Pestiziden mit mehreren Rückständen im Muskelgewebe von Fledermäusen. Sci Rep 12, 7164 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-11352-z

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Eingegangen: 09. Dezember 2021

Angenommen: 22. April 2022

Veröffentlicht: 03. Mai 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-11352-z

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