Qualitativer Immunoassay zur Bestimmung von Tetracyclin-Antibiotikarückständen in Milchproben, gefolgt von einer quantitativ verbesserten HPLC

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 14502 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Umweltschadstoffe sind eines von mehreren Problemen, die Menschen und Wildtieren schaden. Ein Beispiel für aktuell auftretende Schadstoffe sind Antibiotikarückstände, die in Wasser und Lebensmitteln vorkommen können. Obwohl Antibiotika zur Behandlung oder Vorbeugung von Infektionen bei Menschen und Tieren gedacht sind, werden Antibiotika aufgrund ihrer Fähigkeit, das Wachstum und die Futtereffizienz zu fördern, auch als Nahrungsergänzungsmittel für Tiere eingesetzt. Dieser übermäßige Einsatz antibakterieller Mittel hat zur Anhäufung von Antibiotikarückständen in Lebensmitteln geführt, die schließlich vom Menschen verzehrt werden. Die kontinuierliche unnötige Exposition des Menschen gegenüber Antibiotika durch direkte Tierkontakte oder Milch oder indirekt durch Pflanzen oder Erde kann das Risiko der Entstehung multiresistenter Bakterien erhöhen und sich folglich nachteilig auf die menschliche Gesundheit auswirken. Für den Einsatz von Antibiotika wurden neue Vorschriften erlassen. Aufgrund des Mangels an Daten zu Antibiotikarückständen in verschiedenen Arten von Lebensmitteln, die für den menschlichen Verzehr in Saudi-Arabien bestimmt sind, wurde in dieser Studie eine optimierte chromatographische Methode (HPLC-DAD) gefolgt von einem Immunoassay-Ansatz zum spezifischen Nachweis von Tetracyclin-Antibiotika in Tiermilchproben vorgeschlagen. Die Methode wurde unter Verwendung einer RP-C18-Säule mit einer mobilen Phase bestehend aus 0,01 M KH2PO4: Acetonitril:Methanol (70:20:10, Vol./Vol./Vol.), eingestellt auf pH 4, durchgeführt. Hinsichtlich der Methode wurden Verbesserungen beobachtet Auflösung und Sensibilität. Die zur Extraktion verwendete Proteinfällungsmethode zeigte hohe prozentuale Ausbeuten von 85–101 %. Die Methode wurde gemäß den Richtlinien der International Conference for Harmonization (ICH) validiert. Aus diesen Erkenntnissen geht offensichtlich hervor, dass die Rückstände von Tetracyclin- und Oxytetracyclin-Antibiotika in Milchprodukten vom saudischen Markt unter den maximalen Rückstandsgrenzwerten (MRLs) liegen.

Umweltverschmutzung ist eine Herausforderung, vor der die Welt in diesem Jahrhundert steht. Dieses Problem wird definiert als „die Kontamination der physikalischen und biologischen Komponenten des Systems Erde/Atmosphäre in einem solchen Ausmaß, dass normale Umweltprozesse beeinträchtigt werden“1. Stoffe oder Energie, die über dem natürlichen Niveau liegen, gelten als Schadstoffe1. Antibiotikarückstände sind eine Form von Umweltverunreinigungen, die in Tieren, Pflanzen oder im Boden vorkommen und die Entwicklung mikrobieller Resistenzen fördern können. Mikrobielle Resistenz, die durch unnötigen Einsatz und Kontakt mit Antibiotika entsteht, wird definiert als Veränderungen der bakteriellen Resistenzmechanismen oder die Entwicklung neuer Mechanismen als Reaktion auf bestimmte Antibiotika, eine Klasse von Antibiotika oder mehrere Arten von Antibiotika gegen sogenannte multiresistente Krankheitserreger ( MDR)2. Um die antimikrobielle Wirkung aufrechtzuerhalten, haben die Aufsichtsbehörden den Verschreibungsprozess von Antibiotika eingeschränkt. Antibiotika werden jedoch neben ihrer Verwendung in der Veterinärmedizin auch als Lebensmittelkonservierungsmittel, zur Förderung des Wachstums und zur Steigerung der Produktivität von Rindern und Geflügel eingesetzt3,4,5. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass der Einsatz hoher Antibiotikamengen zur Steigerung der Tierproduktivität mit dem Vorhandensein von Antibiotikarückständen in tierischen Lebensmitteln verbunden ist6,7,8. Die kontinuierliche Exposition des Menschen gegenüber Antibiotikarückständen kann für den Menschen schädlich sein und das Risiko allergischer Reaktionen erhöhen, die normale Darmflora stören oder Antibiotika-resistente Bakterien (ARB) oder Antibiotika-Resistenzgene (ARGs) vom Tier auf den Menschen übertragen.

Tetracyclin (TTR), Chlortetracyclin (CTC) und Oxytetracyclin (OXY) gehören aufgrund ihrer Wirksamkeit und geringen Kosten zu den am häufigsten verwendeten Antibiotika in der Tierhaltung9,10. Viele Studien haben den unangemessenen Einsatz dieser Antibiotika weltweit und die Folgen einer solchen Praxis gezeigt6,11. Beispielsweise kommt es zu einem unkontrollierten Einsatz von Antibiotika im Mischfutter von Tieren oder als Konservierungsmittel in der Lebensmittelindustrie12,13. Darüber hinaus werden den Tieren Antibiotika häufig direkt vor der Schlachtung verabreicht oder unmittelbar nach der Schlachtung in die Halsschlagader injiziert, um die Lagerzeit von Frischfleisch zu verlängern12. Letztendlich können die verbleibenden Antibiotikakonzentrationen die von der Europäischen Union (EU) und der Weltgesundheitsorganisation (WHO) zulässigen maximalen Restmengen (MRLs) überschreiten.

Methoden zur Bestimmung von Tetracyclin-Antibiotika (TCs) wurden mit vielen Analysemethoden in verschiedenen Lebensmittelproben und Umweltproben eingehend untersucht. Beispielsweise bestätigten Al-Ghamdi et al. den Missbrauch von TC-Antibiotika in Geflügelprodukten in der östlichen Region Saudi-Arabiens mithilfe einer mikrobiologischen Methode14. Darüber hinaus haben zwei weitere in der Region Al-Ahsa'a durchgeführte Studien das Vorhandensein von Antibiotikarückständen bei Tieren gezeigt. Die erste Studie verwendete LC-MS/MS, um nach Rückständen von neun Antibiotika (Chinolone, Fluorchinolone, Sulfonamide und Tetracycline) in Geweben von Kamelen, Rindern und Schafen zu suchen15. Der zweite von Al-Nazawi et al. verwendete den Delvotest P Multi-Plattentest, um hauptsächlich auf TCs, Streptomycin und Neomycin in Milchprodukten zu prüfen16.

Ein Großteil der aktuellen Literatur nutzt Flüssigkeitschromatographie in Verbindung mit Massenspektrometrie LC-MS/MS als die am besten geeignete Methode für den Nachweis und die Quantifizierung von Multiklassen-Antibiotika in Lebensmittel- und Milchproben17,18. Weitere Techniken zur Bestimmung von TC-Antibiotikarückständen in Milchproben wurden beschrieben, darunter die Kapillarelektrophorese (CE-FL19 und CE-DAD20), ein mikrobiologischer Nachweis21 und eine spektroskopische Methode22. Daten aus zwei aktuellen Übersichtsartikeln zeigten, dass immunologische Kits als Überwachungsinstrument für Rückstände von Tetracyclin-Antibiotika in Milch verwendet werden12,17. Tabelle 1 fasst einige berichtete chromatographische Methoden zur Bestimmung von TCs-Antibiotikarückständen in Milchproben mittels HPLC-DAD zusammen. Diese Übersichtsartikel weisen auf eine Reihe von Ähnlichkeiten zwischen den veröffentlichten Methoden hin. In der überwiegenden Mehrheit der Studien wurde eine stationäre C18-Phase mit Umkehrphasen-HPLC12 verwendet. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass binäre Gemische aus Wasser-Acetonitril oder Wasser-Methanol mit unterschiedlichen Konzentrationen an organischen Komponenten häufiger verwendet werden als tertiäre Gemische (Wasser-Acetonitril-Methanol). Oxal-, Ameisen-, Essig- und Zitronensäure gehören zu den am häufigsten verwendeten Chemikalien in der mobilen Phase12,23. Es wurde über Gradientenelutionssysteme mit komplexen Proben und Antibiotikamischungen berichtet, die eine Trennung ermöglichen12.

Das Hauptziel der Studie bestand darin, Rückstände von Tetracyclin-Antibiotika in Milchproben aus dem saudischen Markt mittels HPLC in Verbindung mit der DAD-Technik zu bestimmen.

Referenzmaterialien von Oxytetracyclin (98,07 % Reinheit NMR), Tetracyclin (> 98,00 %), Chlortetracyclin (> 95,00 %) und dem internen Standard Ornidazol (ORZ, > 99,00 %) wurden von Haoyuan ChemExpress Co., Ltd. (Shanghai, China) erworben ). Kaliumdihydrogenorthophosphat wasserfrei (KH2PO4) wurde von Loba Chemie Pvt. bezogen. Ltd. (Mumbai, Indien). Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz-Dihydrat (Na2EDTA) wurde von Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Deutschland) bezogen. Orthophosphorsäure (H3PO4) wurde von Avonchem Ltd. (Cheshire, UK) bezogen. Die Lösungsmittel Acetonitril und Methanol in der mobilen Phase waren von UHPLC- und HPLC-Qualität. In allen Experimenten wurde entionisiertes Wasser verwendet. Milchproben wurden auf mehreren lokalen Märkten und Bauernhöfen in der Stadt Riad gekauft. Die Testkits für den Tetracyclin-Schnellimmunoassay wurden von der Meizheng Biotech Group, einem PerkinElmer-Unternehmen (Peking, China), bezogen. Das HPLC-System (Waters, Milford, MA, USA) bestand aus einer binären HPLC-Pumpe Waters 1525, einem Photodiodenarray-Detektor Waters 2998 und einem Autosampler Waters 2707. Die Daten wurden mit der Waters Empower 3-Software erfasst und verarbeitet.

Chromatographische Trennungen wurden auf einer Umkehrphasen-Macherey-Nagel-C18-Säule (250 × 4,5 mm Innendurchmesser, Partikelgröße 5 μm) durchgeführt. Die mobile Phase war eine Mischung aus 10 mM Kaliumdihydrogenorthophosphat: Acetonitril: Methanol in einem Verhältnis von 70:20:10 (v/v/v), und der pH-Wert wurde mit 0,01 M Orthophosphorsäure auf 4 eingestellt. Die mobile Phase wurde durch ein 0,45 µm Whatman-Filterpapier filtriert, anschließend 10 Minuten lang entgast und dann mit einer Flussrate von 1 ml/Minute abgegeben. Die Analyse wurde bei 25 °C durchgeführt und die Elution der Verbindungen wurde mit einem Diodenarray-Detektor (DAD) von 210 bis 600 nm überwacht. Die Chromatogramme wurden bei 358 nm aufgenommen und das Injektionsvolumen betrug 50 µl.

Stammlösungen (1) mit Konzentrationen von 1 mg/ml für OXY, TTR, CTC und internen Standard ORZ wurden in Methanol hergestellt. Eine weitere Verdünnung war erforderlich, um eine gemischte Stammlösung (2) mit einer Konzentration von 10 µg/ml für jede Lösung herzustellen. Die verwendeten Arbeitskonzentrationen betrugen 0,09, 0,3, 0,5, 0,7 und 1 µg/ml. Die interne Standard-Stammlösung (2) wurde separat nach dem gleichen Verfahren hergestellt. Die Lösungen wurden in einem Gefrierschrank (−20 °C) aufbewahrt und für einen Zeitraum von einem Monat vor Licht geschützt24,25.

Milchproben (n = 100) wurden hauptsächlich nach ihrer Art in Kuh-, Kamel- und Ziegenmilch eingeteilt. Weitere Klassifizierungen umfassten die Herkunft (lokales kommerzielles Produkt/importiertes kommerzielles Produkt/lokale Bauernhöfe), die Haltbarkeit (frisch/lang haltbar), den Fettgehalt (Vollfett, fettarme Milch und Magermilch) und die Fütterung (biologisch/nicht biologisch). Informationen zu den Proben sind in Tabelle 2 aufgeführt. Milch wurde in den Monaten Oktober–November 2021 und Februar 2022 auf lokalen saudischen Märkten und Bauernhöfen (Stadt Riad) gekauft.

Bei der Extraktion von Milchproben werden ein organisches Lösungsmittel zur Ausfällung des Proteins und ein Chelatbildner zugesetzt. Diese Technik ist weit verbreitet und wurde in vielen Studien23 eingesetzt. Proben wurden nach dem folgenden Verfahren hergestellt. Der Extraktionsprozess begann mit dem Mischen von 2 ml einer Milchprobe mit 0,4 ml 0,2 M Na2EDTA und 0,6 ml Methanol in Polypropylen-Zentrifugenröhrchen. Sobald sich eine homogene Lösung gebildet hatte, wurde das Röhrchen 20 Minuten lang bei 16.000 U/min zentrifugiert und zur Analyse durch einen 0,22 µm Whatman-Spritzenfilter in ein HPLC-Fläschchen filtriert.

Das Tetracyclin-Schnelltestkit ist ein qualitativer Test, der das Vorhandensein von Tetracyclin-Antibiotikarückständen in Kuh- und Kamelmilch bestimmt. Die Kit-Komponenten sollten vor der Verwendung Raumtemperatur (20–25 °C) erreichen. Milchproben wurden geschüttelt und in die Mikrovertiefungen gegeben (200 µL Kuhmilchproben und 100 µL Kamelmilchproben, verdünnt mit 100 µL entionisiertem Wasser). Das Beschichtungskonjugatpulver wurde durch fünfmaliges Auf- und Abpipettieren des Inhalts gelöst. Die Probenmischungen wurden 2 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, bevor der Teststreifen in die Mikrovertiefungen gegeben wurde. Die Teststreifen wurden 5 Minuten lang auf Farbentwicklung beobachtet, dann entfernt und die Ergebnisse innerhalb von 1 Minute ausgewertet.

Nach Durchsicht der Literatur wurde festgestellt, dass viele TC-Analysemethoden unter Verwendung von Oxalsäure als organischer Säurelösung in der mobilen Phase zusätzlich zu Acetonitril und Methanol als organischen Modifikatoren durchgeführt werden. Vorläufige Experimente unter diesen Bedingungen zeigten die Auswirkungen jeder Komponente der mobilen Phase. Beispielsweise verringerte eine Erhöhung des Acetonitril-Verhältnisses über 20 % die Auflösung erheblich. Um die Methode an Referenzmaterialien zu optimieren, wurden unterschiedliche Konzentrationen von Oxalsäure mit unterschiedlichen Verhältnissen des organischen Modifikators untersucht. Das vorläufige Verhältnis der mobilen Phase betrug 70:20:10 (v/v/v) 10 mM Oxalsäurelösung, Acetonitril bzw. Methanol. In Übereinstimmung mit früheren Veröffentlichungen zeigten unsere Ergebnisse, dass 25 mM Oxalsäure im Vergleich zu anderen getesteten Konzentrationen (0, 10, 40, 50 und 60 mM) eine optimale Auflösung zeigte. Unsere Ergebnisse zeigten auch, dass mit 10 mM Oxalsäure kürzere Retentionszeiten beobachtet wurden.

Bezüglich der organischen Modifikatoren wurde eine Peaktrennung mit zufriedenstellender Auflösung mit Acetonitril allein als organischem Modifikator in einem Verhältnis von 20 % nachgewiesen. Die alleinige Verwendung von Acetonitril hat jedoch zu einer Verlängerung der Retentionszeit auf bis zu 30 Minuten geführt. Dabei zeigte sich, dass sowohl Methanol als auch Acetonitril für optimale Bedingungen notwendig sind. Eine Erhöhung der Verhältnisse über 20 % bzw. 10 % für Acetonitril und Methanol führte zu einer deutlichen Verringerung der Auflösung, wohingegen eine Verringerung dieser Verhältnisse zu einer längeren Laufzeit führte. Diese Ergebnisse stützen im Großen und Ganzen die Arbeit anderer Studien zur Analyse des Standardreferenzmaterials, da diese Methode bei der Anwendung auf Milchmatrizen keine akzeptable Auflösung lieferte. Überraschenderweise wurde eine Peakinterferenz zwischen einer Milchmatrixkomponente und TCs-Peaks nachgewiesen. Daher wurde keine akzeptable Auflösung erzielt, was auf eine weitere Methodenoptimierung an einer aufgestockten Milchmatrix schließen lässt. Die Abbildungen 1 und 2 zeigen einen Überblick über die experimentellen Chromatogramme für die Auswirkungen einer Änderung der Oxalsäurekonzentration auf die mit Arzneimittel versetzte Milchmatrix. Entgegen den Erwartungen gelang es diesen Versuchen nicht, eine vernünftige Lösung zu finden; Trotz der unterschiedlichen Verhältnisse und Konzentrationen gelang es den Methoden nicht, den Matrix-Peak von den Wirkstoff-Peaks zu trennen. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die mobile Phase auf Oxalsäurebasis nicht für Milchmatrizen geeignet ist.

Auswirkungen einer veränderten Oxalsäurekonzentration auf die mit Medikamenten versetzte Kuhmilch. (a) 5 mM Oxalsäure:ACN:MeOH (70:20:10). (b) 10 mM Oxalsäure:ACN:MeOH (70:20:10). (c) 15 mM Oxalsäure:ACN:MeOH (70:20:10). Chromatografische Bedingungen: Injektionsvolumen: 30 µL, Temperatur: 25 °C, Flussrate: 1 ml/min, Detektionswellenlänge: 358 nm.

Auswirkungen einer veränderten Oxalsäurekonzentration auf die mit Medikamenten versetzte Kuhmilch. (a) 25 mM Oxalsäure:ACN:MeOH (70:20:10). (b) 30 mM Oxalsäure:ACN:MeOH (70:20:10). (c) 50 mM Oxalsäure:ACN:MeOH (70:20:10). Chromatografische Bedingungen: Injektionsvolumen: 30 µL, Temperatur: 25 °C, Flussrate: 1 ml/min, Detektionswellenlänge: 358 nm.

Frühere Arbeiten ergaben die Möglichkeit, Oxalsäure durch Kaliumdihydrogenphosphat KH2PO4 als anorganisches Salz in der mobilen Phase zusammen mit den organischen Modifikatoren für die Bestimmung von TCs-Antibiotika zu ersetzen. Beispielsweise wurde die Bestimmung von OXY und TTR in Milchproben mit einem isokratischen Elutionssystem aus 0,05 M Kaliumdihydrogenphosphat (pH 2,8)/ACN (80:20, v/v)26 durchgeführt. Das Ergebnis des vorläufigen praktischen Experiments war vielversprechend und ermutigte zu weiterer Forschung zur Bewertung unterschiedlicher KH2PO4-Konzentrationen mit unterschiedlichen Verhältnissen an organischem Modifikator.

Zunächst wurden 0,025 M KH2PO4 mit ACN und MeOH in unterschiedlichen Verhältnissen getestet. Eine Verringerung von KH2PO4 auf 0,01 M zeigte jedoch eine bessere Auflösung. Abbildung 3 zeigt die Auswirkung der Änderung der Verhältnisse mobiler Zusammensetzungen auf die dotierte Milchmatrix. Das vielleicht bedeutendste Ergebnis ist, dass eine gute Trennung mit der mobilen Phase bei einem Verhältnis von 70:20:10 von KH2PO4: ACN: MeOH erreicht wird. Es wurde jedoch eine Verringerung der Empfindlichkeit festgestellt, was vermutlich auf den Verlust des Pharmakophors in der chemischen Struktur von TCs und die Änderung des pH-Werts der mobilen Phase zurückzuführen war. Daher wurde der pH-Wert der mobilen Phase bewertet, um die Empfindlichkeit zu erhöhen.

Einfluss der KH2PO4-Konzentration auf dotierte Kuhmilch. (a) 25 mM KH2PO4: ACN: MeOH (70:20:10). (b) 10 mM KH2PO4: ACN: MeOH (70:20:10).

Der Einfluss des pH-Werts wurde bewertet, indem 0,1 M Orthophosphorsäure verwendet wurde, um die mobile Phasenmischung aus 0,01 M KH2PO4:ACN:MeOH in einem Verhältnis von 70:20:10 im pH-Bereich von 2–5,5 einzustellen. Die Änderung des pH-Werts wurde hinsichtlich der Auswirkung auf die Auflösung und die Empfindlichkeit bewertet. Ab einem pH-Wert von 5,5 wurde ein Anstieg der Auflösung festgestellt, während in diesem Bereich die Empfindlichkeit verloren ging. Durch Senken des pH-Werts auf etwa 2–3 verbesserte sich die Empfindlichkeit, die Auflösung nahm jedoch ab. Bei pH 4 zeigte die mobile Phase eine zufriedenstellende Auflösung und eine für den Zweck der Studie akzeptable Empfindlichkeit und wurde daher für die Auswertung von Milchproben ausgewählt. Abbildung 4 zeigt ein Chromatogramm für die vorgeschlagene Methode.

Das Chromatogramm der vorgeschlagenen Methode. Chromatografische Bedingungen: 10 mM KH2PO4: ACN: MeOH (70:20:10), Injektionsvolumen: 50 µL, Temperatur: 25 ℃, Flussrate: 1 ml/min, Detektionswellenlänge: 358 nm.

Obwohl nur Spuren von Chlortetracyclin (CTC) nachgewiesen wurden, sorgte die Einstellung des pH-Werts der mobilen Phase auf 4 für eine gute Auflösung und Empfindlichkeit. Alternativ kann das Injektionsvolumen erhöht werden, um die Erkennung zu verbessern und die Quantifizierungsgrenzen für CTC zu senken. Als Faustregel gilt, das Injektionsvolumen so gering wie möglich zu halten, um eine Säulenüberlastung und Peakverbreiterung zu vermeiden27. Es wurde eine allmähliche Erhöhung des Injektionsvolumens untersucht, um sicherzustellen, dass niedrige CTC-Konzentrationen ohne Anzeichen einer Peakverbreiterung nachgewiesen wurden. Das Injektionsvolumen wurde auf 50 µL eingestellt, da es innerhalb der Gerätekapazität liegt, und es wurden keine Anzeichen einer Peakverbreiterung beobachtet (Abb. 4).

Absorptionsspektren der drei Medikamente OXY, TTR und CTC wurden mit einem DAD im Wellenlängenbereich von 200–600 nm untersucht. Die Spektren der drei Medikamente zeigten zwei Lambda-Max-Werte, 267 nm und 358 nm. Als optimale Detektionswellenlänge wurde die Wellenlänge 358 nm gewählt, da die Probenmatrix komplex ist und viele störende Peaks bei 267 nm auftraten. Abbildung 5 zeigt die Absorptionsspektren der Zielanalyten.

Absorptionsspektren der Zielanalyten (a) Oxytetracyclin, (b) Tetracyclin, (c) Chlortetracyclin und (d) Interner Standard.

Das Extraktionsverfahren wurde entwickelt, um eine gute Rückgewinnungsrate zu erzielen und gleichzeitig eine konzentrierte Probe beizubehalten. Zuvor berichtete Methoden zeigten, dass Lebensmittelmatrizen einen hohen Proteingehalt aufweisen, weshalb im Vorbehandlungsschritt eine Proteinfällung eingesetzt wird17. Darüber hinaus haben TCs-Moleküle eine hohe Affinität zur Bildung von Metallkomplex-Chelaten mit mehrwertigen Metallkationen wie Calcium und Magnesium (Ca+2 und Mg+2). Diese Komplexbildung könnte jedoch durch Zugabe eines Chelatbildners zur Probe verhindert werden12. Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und organische Lösungsmittel wie Acetonitril und Methanol wurden in großem Umfang bei der Vorbehandlung von Milchproben23 verwendet. Im vorgeschlagenen Extraktionsverfahren wurden drei Schlüsselfaktoren identifiziert, die sich auf den Wiederfindungsprozentsatz und die Konzentrizität der Probe auswirken könnten: (1) das Volumen des organischen Lösungsmittels, (2) die Konzentration des Chelatbildners und (3) die Zentrifugationszeit und -geschwindigkeit. Das Methanolvolumen wurde auf ein Minimum beschränkt, um eine Probenverdünnung zu verhindern. Bei dieser Methode wurde Natrium-EDTA (Na2-EDTA), das in Wasser leichter löslich ist als EDTA, als Chelatbildner eingesetzt, ohne dass der pH-Wert weiter angepasst werden musste. Es wurde gezeigt, dass eine Erhöhung der Zentrifugationszeit und -geschwindigkeit sowie der Konzentration von Na2-EDTA auf 0,2 M zu einer signifikanten Erhöhung der Überstandstransparenz und der prozentualen Rückgewinnung führte.

Die Methodenvalidierung erfolgte durch statistische Analyse gemäß den Richtlinien des International Council for Harmonization ICH28. Die Validierungsparameter wurden am Arzneimittelreferenzmaterial und an den drei verschiedenen Milchmatrizen (Kuh, Kamel und Ziege) bewertet. Neben Linearität, Nachweis- und Quantifizierungsgrenzen, Präzision und Genauigkeit wurden auch Selektivität und prozentuale Wiederfindung an Milchmatrizen untersucht.

Die Linearitätsreaktion jedes Medikaments wurde durch Auftragen des Verhältnisses der Peakfläche des Medikaments zur Peakfläche des IS gegenüber der Medikamentenkonzentration bestimmt und anschließend wurden die Regressionsgleichungen aufgestellt. Die Kalibrierungskurve war für jedes Arzneimittel linear im Bereich von 0,09–1 µg/ml (90–1000 ng/ml). Die Korrelationskoeffizienten lagen für jedes Arzneimittel bei > 0,9998, was zeigt, dass die Methode im angegebenen Bereich linear ist. Die für die Kalibrierungskurve verwendeten Konzentrationen betrugen 0,09, 0,3, 0,5, 0,7 und 1 µg/ml.

Die Nachweis- und Quantifizierungsgrenzen wurden anhand des Signal-Rausch-Verhältnisses bestimmt. Als Nachweisgrenze wurde ein Signal-Rausch-Verhältnis von 3:1 und als Bestimmungsgrenze ein Signal-Rausch-Verhältnis von 10:1 festgelegt. Die Nachweisgrenzen für OXY und TTR lagen bei 20 ng/ml (0,020 µg/ml), während die Nachweisgrenze für CTC bei 80 ng/ml (0,080 µg/ml) lag. Die Bestimmungsgrenze betrug 50 ng/ml (0,050 µg/ml) für OXY und TTR und 90 ng/ml (0,090 µg/ml) für CTC.

Die Genauigkeit wurde bewertet, indem unterschiedliche Konzentrationen von Arzneimittelmischungen innerhalb des linearen Bereichs und eine feste Konzentration von Ornidazol als IS (0,8 µg/ml) hergestellt und anschließend die prozentuale Wiederfindung und der relative Fehler berechnet wurden. Tabelle 3 zeigt eine gute prozentuale Ausbeute (theoretische Konzentration/praktische Konzentration %) und einen kleinen relativen Fehler für OXY, TTR und CTC. Für die Intraday-Präzision wurden dieselben Arzneimittelkonzentrationen, die zur Bewertung der Genauigkeit verwendet wurden, dreimal am selben Tag und dann an den nächsten beiden Tagen analysiert, um die Interday-Präzision zu bewerten. Die Werte der relativen Standardabweichung (RSD) wurden für jedes Arzneimittel und jede Konzentration in Tabelle 3 berechnet. Niedrige RSD-Werte (< 2) weisen auf ein hohes Maß an Präzision hin.

Die Selektivität der Methode wurde durch die Untersuchung des Chromatographen der leeren Milchprobe (frei von durch Immunoassay und HPLC getesteten Analyten vor dem Aufstocken) im Vergleich zu einer aufgestockten Milch- und Wasserprobe beurteilt. Alle drei Milchmatrizen zeigten bei den Retentionszeiten der Analyten keine störenden Peaks; Somit erwies sich die Methode als spezifisch für TCs in der Milchmatrix. Abbildung 6 zeigt ein Beispiel für die Selektivität der Methode bei Kuhmilch (die Leermilchprobe im Vergleich zur aufgestockten Milch- und Wasserprobe).

Selektivität der Kuhmilchmatrix. mobile Phase: 10 mM KH2PO4:ACN: MeOH (70:20:10), pH 4.

Die Wiederfindungsprozentsätze wurden als Verhältnis der Reaktion der versetzten Milch zu den versetzten Wasserproben bei derselben Konzentration berechnet. Die prozentuale Wiederfindung von OXY, TTR und CTC in der Milchmatrix lag im angegebenen Bereich (80–120 %). Die mittleren Wiederfindungsprozentsätze ± SD von OXY, TTR und CTC in Kuhmilch betrugen 94,45 % ± 4,00, 88,77 % ± 3,89 bzw. 89,86 % ± 2,41. Für Kamel- und Ziegenmilch betrugen sie 101,20 % ± 4,05, 98,43 % ± 2,28 und 89,33 % ± 11,03 und (96,45 % ± 2,10, 92,73 % ± 3,95 bzw. 86,70 % ± 1,95 für OXY, TTR und CTC.

Die Linearitätsreaktion jedes Arzneimittels in den drei Milchmatrizen wurde durch Auftragen des Verhältnisses der Arzneimittelpeakfläche zur Peakfläche von IS gegenüber der zugesetzten Arzneimittelkonzentration in der leeren Milchprobe bestimmt. Anschließend wurden die Regressionsgleichungen erstellt und in der Tabelle dargestellt 4. Die Kalibrierungskurven waren im Bereich von 0,09–1 µg/ml für OXY und TTR linear, während der Bereich von CTC 0,200–1 µg/ml (200–1000 ng/ml) betrug. Die Korrelationskoeffizienten lagen für jedes Arzneimittel bei ≥ 0,9997, was zeigt, dass die Methode in einem bestimmten Bereich linear ist. Die für die Kalibrierungskurve verwendeten Konzentrationen betrugen 0,09, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 und 1 µg/ml.

Die Nachweis- und Quantifizierungsgrenzen wurden anhand des Signal-Rausch-Verhältnisses bestimmt. Als Nachweisgrenze wurde ein Signal-Rausch-Verhältnis von 3:1 und als Bestimmungsgrenze ein Signal-Rausch-Verhältnis von 10:1 festgelegt. Tabelle 4 zeigt die Regressionsgleichungen und r-Werte für jedes Arzneimittel in Milchmatrizen zusätzlich zur Nachweisgrenze (LOD) und Quantifizierungsgrenze (LOQ). Obwohl der MRL von CTC in Milch 0,100 µg/ml betrug, lag hier die am häufigsten nachgewiesene CTC-Konzentration in der Milchmatrix bei 0,180 µg/ml, und die Quantifizierungsfähigkeit begann erst bei 0,200 µg/ml, was als Nachteil angesehen wird die Methode.

Präzision und Richtigkeit wurden in dotierten Milchproben untersucht und dreimal am selben Tag und an den drei aufeinanderfolgenden Tagen analysiert. Tabelle 5 zeigt, dass die vorgeschlagene Methode ein hohes Maß an Genauigkeit und Präzision aufweist.

Der methodische Ansatz dieser Studie ist eine Kombination aus qualitativer und quantitativer Analyse. Durch die Verwendung eines qualitativen Ansatzes war es einfacher, diese explorative Studie mit dem Ziel durchzuführen, die größtmögliche Stichprobengröße zu scannen. Die Immunoassay-Technik ist nützlich, um positive Proben in kurzer Zeit zu identifizieren. Bei dem verwendeten TCs-Schnelltestkit handelt es sich um einen Lateral-Flow-Assay, mit dem TCs-Rückstände in Kuh- und Kamelmilch (100 µg/kg) qualitativ bestimmt werden können. Ein Teststreifen besteht aus einem Sorptionskissen am unteren Ende und zwei Linien auf einer Nitrozellulosemembran (T-Linie und C-Linie). Die T-Linie ist die Testlinie, die TCs-Moleküle bindet, während die C-Linie die Kontrolllinie ist, die die sekundären Antikörper bindet, um die Gültigkeit des Teststreifens anzuzeigen. Der Hauptbestandteil des Tests sind die goldkonjugierten Tetracyclin-Antikörper, die vor dem Einführen des Teststreifens mit der Probe vermischt werden sollten. Das Kit ist für jedes TC-Antibiotikum nicht selektiv und seine Empfindlichkeitswerte (Nachweisgrenzen) wurden mit 14 µg/kg für TTR und CTC und 10 µg/kg für OXY und Doxycyclin angegeben.

Abbildung 7 zeigt die visuelle Darstellung der Testergebnisse für positive und negative Proben sowie der ungültigen Ergebnisse. Die Interpretation des Ergebnisses basiert auf der Visualisierung und dem Vergleich der Farbintensitäten, um festzustellen, ob die TCs-Rückstände in der Probe größer als der MRL (100 µg/kg) sind oder innerhalb des Grenzwerts liegen, sodass eine Quelle von Verzerrungen oder Unsicherheiten aufgrund von besteht der selbstberichtete Charakter des Ergebnisses als Beobachtungsstudie. Um die falsch negative Interpretation des Ergebnisses zu minimieren, wurde dieses Kit verwendet, um festzustellen, ob TCs-Antibiotikarückstände in einer Probe vorhanden waren, unabhängig vom Gehalt, d. h. der Probe, die einen nahezu oder gleichen Grad an Farbähnlichkeit zwischen der T-Linie aufweist und die C-Linie wird als positive Probe betrachtet und daher zur weiteren Bestimmung durch HPLC-DAD-Analyse mit den positiven Proben (nur C-Linie sichtbar oder schwache T-Linie) kategorisiert.

Negative Probe (−): Die Probe ist frei von Tetracyclinrückständen, wenn die Intensität der T-Linie größer als die der C-Linie ist, und sie liegt unter dem Grenzwert, wenn ihre Intensitäten ähnlich sind. Positive Probe (+): TCs-Antibiotikarückstände entsprechen dem Grenzwert, wenn die Intensität der T-Linie schwächer als die der C-Linie ist, und sie sind größer als der Grenzwert, wenn nur die C-Linie sichtbar ist. Ungültiges Ergebnis: wenn die C-Linie unsichtbar ist.

Zur Qualitätskontrolle wurden zusätzlich zu einer mit 100 ng/ml versetzten Milchprobe eine Positivkontrolle (Tetracyclin: 14 ppm = 14 ng/ml) und eine negative Kontrollprobe gemäß den Anweisungen hergestellt und bei jedem Einsatz des Kits getestet TCs. Dieses Verfahren stellt die Empfindlichkeit und Gültigkeit des Kits während der Lagerzeit sicher. Darüber hinaus wurde eine Zufallsprobe jeder der fünf negativen Proben einer HPLC-DAD-Analyse unterzogen, um das Immunoassay-Ergebnis zu bestätigen.

Kuh- und Kamelmilchproben wurden zunächst mit dem Immunoassay-Kit auf TC-Antibiotikarückstände gescannt. Nur Proben, die im Immunoassay-Kit eine dunkle T-Linie im Vergleich zur C-Linie mit TC-Antibiotikarückständen zeigten, wurden als negative Probe betrachtet und von der HPLC-DAD-Analyse ausgeschlossen. Proben, die nur eine C-Linie oder eine T-Linie zeigten, die schwach war oder in ihrer Intensität der C-Linie ähnelte, wurden zusammen mit den Ziegenmilchproben mittels HPLC-DAD auf TCs-Antibiotikarückstände untersucht. Am Tag der Analyse wurden dotierte Wasser- und Milchproben vorbereitet und injiziert, um die Eignung des chromatographischen Systems sicherzustellen. Anschließend wurden Milchproben vorbereitet und in das HPLC-DAD-System injiziert. Die Retentionszeiten dieser Peaks wurden mit den Retentionszeiten und UV-Spektren der aufgestockten Milchproben verglichen. Der folgende Schritt bestand darin, diese Proben mit einer bekannten Konzentration der Arzneimittel zu versetzen und sie dann zweimal zu injizieren und ihre maximale Reinheit zu untersuchen, um jegliche Matrixinterferenz auszuschließen. Der Gehalt an TC-Antibiotikarückständen wurde durch Berechnung ihrer Konzentration im Vergleich zu versetzter Milch mit einer bekannten Konzentration der Arzneimittel bestimmt. Der Arbeitsablauf ist in Abb. 8 dargestellt.

Schematische Darstellung des Arbeitsablaufs.

Für den qualitativen Test an Kuh- und Kamelmilch (es gab 18 positive Proben in zwei Milcharten; 17 Proben waren Kuhmilch und 1 Probe war Kamelmilch). Diese positiven Proben wurden mit der vorgeschlagenen Methode weiter analysiert, um die Rückstände von TC-Antibiotika zu bestimmen.

Wie Tabelle 6 zeigt, lag das Vorkommen von TCs-Rückständen in Milchprodukten (Probengröße = 100) unter dem MRL (0,1 µg/ml). Die wichtigsten nachgewiesenen Antibiotika waren OXY und TTR, wobei die Konzentrationen in den meisten positiven Proben unter dem MRL lagen. Bezüglich der Gesamtrückstände von TC-Antibiotika überschritten nur 9 Proben (11,54 %) den MRL. CTC wurde in keiner der Proben nachgewiesen, was möglicherweise auf die Nachweisgrenze dieser Methode (0,180 µg/ml) zurückzuführen ist, die über dem MRL lag. Diese Tatsache wird jedoch nicht bestätigt, da die positiven Proben andere TC-Antibiotika enthalten und die Verwendung von CTC eingeschränkt ist.

TCs werden in der Veterinärmedizin häufig als Antibiotika oder Wachstumsförderer eingesetzt. Die unsachgemäße Verwendung oder das Fehlen klarer Verwendungsprotokolle kann dazu führen, dass ihre Rückstände in tierischen Produkten enthalten sind. Unsere HPLC-DAD-Methode zeigt verbesserte Auflösungs- und Empfindlichkeitsparameter, die gemäß den Richtlinien des ICH validiert wurden. Die Wiederherstellungsraten sind hoch (85–100 %) bei minimalen Matrixeffekten. Unser Ergebnis zeigt, dass in den meisten Milchproben, die vom saudischen Markt stammen, die TC-Rückstände unter dem MRL für TTR und OXY liegen. Die einzigen Ausnahmen waren 7,5 % der Proben, die den MRL-Wert für TTR überschritten, und 11,5 % der Proben, die den MRL-Wert für die Summe von TTR und OXY, jedoch nicht für OXY allein, überschritten. Unsere Daten spiegeln die gute klinische Praxis dieser beiden TCs in Bezug auf den Einsatz bei der Tierfütterung und -behandlung in Saudi-Arabien wider. Unsere Methode war für die Bestimmung von CTC in Milchproben nicht geeignet, da ihre Bestimmungsgrenze das Doppelte des MRL beträgt. Daher ist eine weitere Optimierung der Empfindlichkeit erforderlich, damit die Methode CTC-Rückstände in Milchproben bestimmen kann. Wir empfehlen die gleichzeitige Verwendung anderer Analysetechniken wie Immunoassays bei der routinemäßigen Überwachung von TCs sowie die Ausweitung der verwendeten Proben auf Milch von Einzelbetrieben und nichtgewerblichen Betrieben, um die Praxis von Wartezeiten und Behandlungsprotokollen genauer zu untersuchen.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel enthalten.

Muralikrishna, IV & Manickam, V. Einführung. In Environmental Management 1–4 (Elsevier, 2017).

Google Scholar

Save, N. & Deshpande, S. Kommende Trends zur Bekämpfung von Antibiotikaresistenzen. Indian Drugs 55, 7–19 (2018).

Artikel Google Scholar

Van Boeckel, TP et al. Globale Trends beim Einsatz antimikrobieller Mittel bei Nutztieren. Proz. Natl. Acad. Wissenschaft. USA 112, 5649–5654 (2015).

Artikel ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Capita, R. & Alonso-Calleja, C. Antibiotikaresistente Bakterien: Eine Herausforderung für die Lebensmittelindustrie. Krit. Rev. Food Sci. Nutr. 53, 11–48 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kirchhelle, C. Pharming Animals: Eine globale Geschichte von Antibiotika in der Lebensmittelproduktion (1935–2017). Palgrave Commun. 4, 1–13 (2018).

Artikel Google Scholar

Darwish, WS et al. Antibiotikarückstände in Lebensmitteln: Das afrikanische Szenario. Jpn. J. Tierarzt. Res. 61, S13-22 (2013).

PubMed Google Scholar

Kumar, A., Panda, AK & Sharma, N. Bestimmung von Antibiotikarückständen in Rindermilch mittels HPLC-DAD und Bewertung der Risiken für die menschliche Gesundheit in der nordwestlichen Himalaya-Region. Indien. J. Lebensmittelwissenschaft. Technol. 59, 95–104 (2022).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sharma, A., Kumar, A. & Sharma, N. Vorkommen von Antibiotikarückständen in Milch: Erkennung und Bedenken für die öffentliche Gesundheit. J. Tierfutterwissenschaft. Technol. 10, 23–29 (2022).

Google Scholar

Landers, TF, Cohen, B., Wittum, TE & Larson, EL Ein Überblick über den Einsatz von Antibiotika bei Nutztieren: Perspektive, Politik und Potenzial. Public Health Rep. 127, 4–22 (2012).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Mund, MD, Khan, UH, Tahir, U., Mustafa, B.-E. & Fayyaz, A. Rückstände antimikrobieller Arzneimittel in Geflügelprodukten und Auswirkungen auf die öffentliche Gesundheit: Eine Übersicht. Int. J. Food Prop. 20, 1433–1446 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Liu, X., Steele, JC & Meng, X.-Z. Verwendung, Rückstände und Risiko für die menschliche Gesundheit von Antibiotika in der chinesischen Aquakultur: Ein Überblick. Umgebung. Umweltverschmutzung. 223, 161–169 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Udalova, AYu., Dmitrienko, SG & Apyari, VV Methoden zur Trennung, Vorkonzentration und Bestimmung von Tetracyclin-Antibiotika. J. Anal. Chem. 70, 661–676 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Kumar, A., Patyal, A. & Panda, AK Subtherapeutischer Einsatz von Antibiotika in Tierfutter und ihre möglichen Auswirkungen auf die Umwelt und die menschliche Gesundheit: Eine umfassende Übersicht. J. Tierfutterwissenschaft. Technol. 6, 15–25 (2018).

Google Scholar

Al-Ghamdi, MS et al. Rückstände von Tetracyclinverbindungen in Geflügelprodukten in der Ostprovinz Saudi-Arabiens. Öffentliche Gesundheit 114, 300–304 (2000).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

El-Ghareeb, WR, Mulla, ZS, Meligy, AMA, Darwish, WS & Edris, AM Antibiotikarückstandswerte in Geweben von Kamelen, Rindern und Schafen unter Verwendung der LC-MS/MS-Methode. Der J. Anim. Pflanzenwissenschaft. 29, 943–952 (2019).

CAS Google Scholar

Al-Nazawi, M. Resistenzen und Rückstände antibakterieller Mittel in Milchviehbetrieben und Milchproduktion in der Region Al-Hassa in Saudi-Arabien. J. Med. Wissenschaft. 6, 198–202 (2006).

Artikel Google Scholar

Chen, J., Ying, G.-G. & Deng, W.-J. Antibiotikarückstände in Lebensmitteln: Extraktion, Analyse und Bedenken für die menschliche Gesundheit. J. Agrar. Lebensmittelchem. 67, 7569–7586 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Önal, A. Überblick über die flüssigkeitschromatographische Analyse von Tetracyclinrückständen in Lebensmittelmatrizen. Lebensmittelchem. 127, 197–203 (2011).

Artikel Google Scholar

Ma, T.-Y., Vickroy, TW, Shien, J.-H. & Chou, C.-C. Verbesserte nichtwässrige Kapillarelektrophorese für Tetracycline im Subparts per Billion-Bereich: CE und CEC. Elektrophorese 33, 1679–1682 (2012).

Artikel PubMed Google Scholar

Ibarra, IS, Rodriguez, JA, Miranda, JM, Vega, M. & Barrado, E. Magnetische Festphasenextraktion auf Basis eines Phenylkieselsäureadsorbens zur Bestimmung von Tetracyclinen in Milchproben durch Kapillarelektrophorese. J. Chromatogr. A 1218, 2196–2202 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Nagel, OG, Molina, MP & Althaus, RL Optimierung des Bioassays zum Nachweis von Tetracyclin in Milch mittels chemometrischer Techniken: Bioassay zum Nachweis von Tetracyclin in Milch. Lette. Appl. Mikrobiol. 52, 245–252 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Divya, MP, Rajput, YS & Sharma, R. Synthese und Anwendung von Tetracyclin-geprägtem Polymer. Anal. Lette. 43, 919–928 (2010).

Artikel CAS Google Scholar

Sabbya, S., Ferdous, J., Sikder, MH & Azizul Karim Hussani, SM Antibiotikarückstände in Milch: Vergangenheit, Gegenwart und Zukunft. J. Adv. Tierarzt. Anim. Res. 6, 315–332 (2019).

Artikel Google Scholar

Podhorniak, LV, Leake, S. & Schenck, FJ Stabilität von Tetracyclin-Antibiotika in Rohmilch unter Laborlagerbedingungen. J. Lebensmittelschutz. 62, 547–548 (1999).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wang, W. et al. (2018) Stabilitätsstudien von Oxytetracyclin in Methanollösung. In: IOP Conference Series Earth Environmental Science, Bd. 113, S. 012110.

Saleh, H., Elhenawee, M., Hussien, EM, Ahmed, N. & Ibrahim, AE Validierung der HPLC-UV-Multirückstandsmethode zur gleichzeitigen Bestimmung von Tetracyclin, Oxytetracyclin, Spiramycin und Neospiramycin in Rohmilch. Essen Anal. Methoden 14, 36–43 (2020).

Artikel Google Scholar

Fornstedt, T., Forssén, P. & Westerlund, D. Grundlegende HPLC-Theorie und Definitionen: Retention, Thermodynamik, Selektivität, Zonenausbreitung, Kinetik und Auflösung. In Analytical Separation Science 1–24 (John Wiley & Sons, 2015).

Google Scholar

Internationale Konferenz zur Harmonisierung technischer Anforderungen für die Registrierung von Arzneimitteln für den menschlichen Gebrauch. Harmonisierte dreigliedrige ICH-Leitlinie: Validierung analytischer Verfahren: Text und Methodik Q2 (R1). https://database.ich.org/sites/default/files/Q2_R1__Guideline.pdf (2005).

Saridal, K. & Ulusoy, HI Eine einfache Methode, die auf der Trübungspunktextraktion vor der HPLC-PDA-Analyse auf Tetracyclinrückstände in Lebensmittelproben basiert. Mikrochem. J. 150, 104170 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Sun, X., He, X., Zhang, Y. & Chen, L. Bestimmung von Tetracyclinen in Lebensmittelproben durch molekular geprägte monolithische Säulenkopplung mit Hochleistungsflüssigchromatographie. Talanta 79, 926–934 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Fritz, J. & Zuo, Y. Gleichzeitige Bestimmung von Tetracyclin, Oxytetracyclin und 4-Epitetracyclin in Milch durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie. Lebensmittelchem. 105, 1297–1301 (2007).

Artikel CAS Google Scholar

Tsai, W.-H., Huang, T.-C., Huang, J.-J., Hsue, Y.-H. & Chuang, H.-Y. Dispersive Festphasen-Mikroextraktionsmethode zur Probenextraktion bei der Analyse von vier Tetracyclinen in Wasser- und Milchproben mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie mit Diodenarray-Detektion. J. Chromatogr. A 1216, 2263–2269 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Karageorgou, E., Armeni, M., Moschou, I. & Samanidou, V. Ultraschallunterstützte dispersive Extraktion zur Hochdruckflüssigkeitschromatographie-Bestimmung von Tetracyclinrückständen in Milch mit Diodenarray-Detektion. Lebensmittelchem. 150, 328–334 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

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Abteilung für Pharmazeutische Chemie, Fakultät für Pharmazie, King Saud University, Riad, Saudi-Arabien

Moneera N. Alnassrallah, Nourah Z. Alzoman und Aliyah Almomen

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Korrespondenz mit Nourah Z. Alzoman.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Alnassrallah, MN, Alzoman, NZ & Almomen, A. Qualitativer Immunoassay zur Bestimmung von Tetracyclin-Antibiotikarückständen in Milchproben, gefolgt von einer quantitativ verbesserten HPLC-DAD-Methode. Sci Rep 12, 14502 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-18886-2

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Eingegangen: 26. April 2022

Angenommen: 22. August 2022

Veröffentlicht: 25. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-18886-2

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