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Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 10693 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Infektionskrankheiten gehören weltweit zu den häufigsten Todesursachen. Ein neues Coronavirus mit dem Namen „Severe Acute Respiratory Syndrome Corona Virus 2“ (SARS-CoV-2) wurde 2019 in Wuhan, China, identifiziert und die Weltgesundheitsorganisation (WHO) erklärte seinen Ausbruch, die Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19), als „Coronavirus-Krankheit 2019“. globale Pandemie im Jahr 2020. COVID-19 kann sich schnell von Mensch zu Mensch verbreiten. Eine der größten Herausforderungen besteht darin, die infizierten Personen zu identifizieren und eine mögliche Ausbreitung von SARS-CoV-2 zu verhindern. In jüngster Zeit werden Anti-SARS-CoV-2-Immunglobulin M (IgM)- und Immunglobulin G (IgG)-Antikörpertests mit immunchromatographischen Methoden als Ergänzung zu aktuellen Nachweismethoden eingesetzt und liefern Informationen über den ungefähren Verlauf einer COVID-19-Infektion. Allerdings verursacht die Blutentnahme Schmerzen und birgt die Gefahr einer Infektion an der Einstichstelle der Nadel. In dieser Studie wurde ein neuartiger Patch-Sensor mit porösen Mikronadeln und einem immunchromatographischen Assay (PMNIA) für den schnellen Nachweis von Anti-SARS-CoV-2-IgM/IgG in dermaler interstitieller Flüssigkeit (ISF), einer reichhaltigen Proteinquelle, entwickelt Biomarker wie Antikörper. Biologisch abbaubare poröse Mikronadeln (MNs) aus Polymilchsäure wurden hergestellt, um ISF durch Kapillarwirkung aus der menschlichen Haut zu extrahieren. Das extrahierte ISF wurde vertikal transportiert und floss in den angebrachten Immunoassay-Biosensor, wo spezifische Antikörper vor Ort kolorimetrisch nachgewiesen werden konnten. Anti-SARS-CoV-2-IgM/IgG-Antikörper wurden gleichzeitig innerhalb von 3 Minuten in vitro nachgewiesen. Darüber hinaus lag die Nachweisgrenze der Anti-SARS-CoV-2-IgM- und IgG-Konzentrationen bei nur 3 bzw. 7 ng/ml. Das entwickelte Gerät, das poröse MNs und immunchromatographische Biosensoren integriert, soll minimalinvasive, einfache und schnelle Anti-SARS-CoV-2-IgM/IgG-Antikörpertests ermöglichen. Darüber hinaus ist die kompakte Größe des MN- und Biosensor-integrierten Geräts für seine weit verbreitete Verwendung von Vorteil. Das vorgeschlagene Gerät hat großes Potenzial für das schnelle Screening verschiedener Infektionskrankheiten zusätzlich zu COVID-19 als wirksame Ergänzungsmethode zu anderen diagnostischen Tests.

Ende 2019 wurde ein neuartiges Coronavirus, das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), identifiziert, das die Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) verursacht. Aufgrund seiner hohen Infektiosität verbreitete es sich innerhalb von 3 Monaten weltweit1,2. Im März 2020 erklärte die Weltgesundheitsorganisation (WHO) den Ausbruch von COVID-19 zu einer globalen Pandemie3. Eine COVID-19-Infektion breitet sich schnell von Mensch zu Mensch aus und zu den Symptomen gehören Müdigkeit, Husten, Fieber, Atemnot, Anosmie und Ageusie; Zu den schwerwiegenderen Symptomen gehört eine Ateminsuffizienz, die lebensbedrohlich sein kann4,5. Darüber hinaus wird die Rate asymptomatischer Infektionen mit 16–38 % angegeben, was die Identifizierung aller mit SARS-CoV-2 infizierten Personen erschwert6. COVID-19-Impfstoffe reduzieren wirksam das Infektionsrisiko und die Virusübertragung; Allerdings liegt der Anteil der vollständig gegen COVID-19 geimpften Bevölkerung in mehreren Ländern mit niedrigem Einkommen weiterhin unter 10 %7,8. Daher besteht eine der aktuellen globalen Herausforderungen darin, sowohl symptomatische als auch asymptomatische Patienten zu identifizieren, um eine mögliche Ausbreitung von SARS-CoV-2 zu verhindern.

Derzeit ist die Echtzeit-Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) die vorherrschende Nachweismethode und bleibt der Goldstandard für die COVID-19-Diagnose9. Mit dieser Methode sind jedoch bestimmte Nachteile verbunden, die einen schnellen Nachweis von COVID-19 erschweren: (1) Für die Durchführung einer Echtzeit-RT-PCR sind eine umfangreiche Laborinfrastruktur und gut ausgestattete Einrichtungen erforderlich. (2) Für die Entnahme naso- oder oropharyngealer Abstrichproben und die Bedienung hochentwickelter Laborinstrumente sind gut ausgebildete Medizintechniker erforderlich. (3) Die Gesamtdurchlaufzeit für Echtzeit-RT-PCR-Tests ist lang (4–6 Stunden), was das Risiko einer Kreuzkontamination birgt10. Da die Echtzeit-RT-PCR-Diagnose von COVID-19 teuer und zeitaufwändig ist und medizinisches Personal erfordert, ist dies in vielen Ländern mit begrenzten Ressourcen nicht möglich.

Neben dem Nachweis von SARS-CoV-2 in Proben aus dem Nasen- und Rachenraum ist die Untersuchung von Anti-SARS-CoV-2-Immunglobulin-M- (IgM) und Immunglobulin-G-Antikörpern (IgG) eine gute Alternative zur Bestätigung von COVID -19-Infektion11,12,13. Den bisherigen Untersuchungen zufolge konnten durch SARS-CoV-2 erzeugte IgM und IgG bei 31,8–40,9 % der Patienten 0–5 Tage nach Symptombeginn14 nachgewiesen werden, während 94 % bzw. 100 % der Patienten positiv auf Anti-SARS getestet wurden -CoV-2 IgM bzw. IgG innerhalb von 3 Wochen nach Symptombeginn15. Darüber hinaus kann das Stadium der COVID-19-Infektion ungefähr bekannt sein, da der Anti-SARS-CoV-2-IgM-Antikörper die erste Antikörperreaktion auf die anfängliche Exposition gegenüber SARS-CoV-2-Antigenen ist, die innerhalb einer Woche nach Symptombeginn ihren Höhepunkt erreicht nach 2–3 Wochen und sinkt dann bei den meisten Patienten auf ein niedriges Niveau16. Im Gegensatz dazu wurde 3 Wochen nach Symptombeginn ein Plateau des IgG-Spiegels beobachtet, der zwischen 3 und 8 Wochen auf seinen Höhepunkt anstieg und lange Zeit auf einem hohen Niveau blieb16. Daher kann der Nachweis sowohl von IgM als auch von IgG schlüssige Informationen über den ungefähren Verlauf einer COVID-19-Infektion liefern. Darüber hinaus lag laut der vorherigen Studie über Anti-SARS-CoV-2-Spike-Protein-Rezeptor-Bindungsdomäne (RBD)-IgG in Blutproben dessen Konzentration nach Einsetzen der Symptome im Bereich von 331–25,7 µg/ml17, während die Konzentration des Ziel-IgG in Das Rekonvaleszenzserum betrug 7–2100 ng/ml18. Darüber hinaus zeigte IgM gegen SARS-CoV-2-Spike-RBD im Plasma/Serum nach Einsetzen der Symptome eine ähnliche Konzentration wie IgG19. Heutzutage werden LFIA-Streifen (Lateral-Flow-Immunchromatographie-Assay) auf der Basis von Goldnanopartikeln (AuNPs) häufig zum schnellen Nachweis von SARS-CoV-2-spezifischen Antikörpern verwendet20,21,22,23,24,25,26. Normalerweise müssen Einzelpersonen bei der Verwendung des Selbsttests COVID-19 LFIA ihre Blutprobe mit einer Stechhilfe entnehmen und sie dann sofort in die Probenvertiefung der Kassette einpipettieren27. Anschließend werden zur Verdünnung der Probe 2–3 Tropfen Laufpuffer in die Probenvertiefung gegeben. Die verdünnte Blutprobe fließt durch den Teststreifen und die kolorimetrische Markierung kann innerhalb von 10–20 Minuten abgelesen werden. Aufgrund der einfachen Bedienung und des Verzichts auf komplexe Instrumente oder Schritte haben sich LFIA-Streifen zum Testen von Anti-SARS-CoV-2-Antikörpern in vielen Ländern als zuverlässige Plattform für Point-of-Care-Tests (POC) etabliert. Noch wichtiger ist, dass SARS-CoV-2-spezifische Antikörper sowohl bei asymptomatischen Patienten als auch bei Personen mit negativen RT-PCR-Ergebnissen, die engen Kontakt zu COVID-19-infizierten Patienten hatten, nachgewiesen werden konnten15, und daher kann der Zielantikörpernachweis als Maßnahme eingesetzt werden Ergänzung zum Echtzeit-RT-PCR-Test. Durch einen Fingerstich verursachte Blutungen können jedoch Schmerzen verursachen und das Risiko einer Infektion oder sogar einer Kreuzkontamination erhöhen28. Darüber hinaus müssen Patienten die Bestandteile des Testkits entsorgen, da es sich dabei um potenziell biologisch gefährlichen Abfall handelt. Daher sind minimalinvasive und einfach anzuwendende Methoden dringend erforderlich, um einen schnellen Nachweis von SARS-CoV-2-spezifischen Antikörpern zu erreichen.

In den letzten Jahrzehnten gab es einen zunehmenden Trend zur Verwendung von Mikronadeln (MNs). Im Jahr 1998 wurden MNs ursprünglich entwickelt, um die Machbarkeit einer schmerzlosen transdermalen Arzneimittelabgabe zu demonstrieren29. Die Mikrostruktur von MNs ermöglicht es ihnen, in die menschliche Haut einzudringen, ohne Nervenenden zu stimulieren, was den Prozess schmerzlos macht und bei minimaler und besserer Patientencompliance30. In jüngster Zeit haben sich MNs als leistungsstarke Plattform für die Probenahme interstitieller Flüssigkeit (ISF) sowie für die Biosensorik und Überwachung verschiedener Arten von Biomarkern wie Glukose31,32,33,34, Cholesterin35,36 und Proteinbiomarker37,38,39 herausgestellt. Bisher wurden hohle, quellbare und poröse MNs für die ISF-Extraktion entwickelt. Hohle MNs mit einer internen Leitung bestehen jedoch üblicherweise aus Silizium40, Metall36 oder nicht auflösendem Polymer38,41; Daher können sie, wenn sie in die Haut eindringen, den menschlichen Körper schädigen. Quellbare MNs erfordern in der Regel eine Nachbearbeitung, um den Zielanalyten durch Zentrifugation oder Lösungsmittelextraktion zurückzugewinnen34,35. Hier könnten poröse MNs diese Probleme lösen. In jüngster Zeit wurden poröse MNs mit miteinander verbundenen Mikrosporen innerhalb der gesamten MN-Struktur in den Fokus gerückt. Poröse MNs wurden innerhalb eines Jahrzehnts zum Sammeln des dermalen ISF entwickelt, während verschiedene biokompatible und biologisch abbaubare Polymere erfolgreich zur Herstellung poröser Strukturen eingesetzt wurden42. Die ISF-Extraktion kann dank poröser Strukturen im Mikrometerbereich durch Kapillarwirkung erfolgen. Darüber hinaus kann ein Lab-on-Chip-Biosensorgerät zur anschließenden Analyse und Krankheitsdiagnose direkt an den porösen MNs angebracht werden31,43. Daher kann ein Immunoassay-Biosensor entwickelt und in poröse MNs integriert werden, um IgM- und IgG-Antikörper gegen SARS-CoV-2 im ISF einfach und schnell nachzuweisen. Aufgrund der durchgehenden Hohlräume im MN ist die MN-Struktur jedoch fragiler und es besteht daher ein Kompromiss zwischen Porosität und mechanischer Festigkeit.

Bei der Ex-vivo-Analyse war die Blutentnahme bislang mit Abstand vorherrschend. Andere periphere Bioflüssigkeiten wie Tränen, Schweiß, Speichel und Urin wurden als alternative Probenquellen verwendet, aber die Konzentration der Biomarker zeigte eine schlechte Korrelation mit der von Blut34,44. Andere Körperflüssigkeiten wie ISF, die sich in den Epidermis- und Dermisschichten der menschlichen Haut befinden, wurden jedoch aufgrund der Schwierigkeiten bei der minimalinvasiven Probenahme und der ausreichenden Sammlung für die anschließende Ex-vivo-Analyse nicht umfassend in medizinische Anwendungen einbezogen39,44. Mittlerweile wird berichtet, dass ISF, das sich hauptsächlich in den Epidermis- und Dermisschichten der menschlichen Haut befindet, eine breite Palette von Metaboliten und Proteinen (z. B. Antikörper) enthält, die eine enge Korrelation mit denen im Blut aufweisen13,37. Darüber hinaus wird berichtet, dass der Antikörperspiegel im ISF etwa 15–25 % des Blutspiegels beträgt45. Daher sollte die Konzentration des Anti-SARS-CoV-2-IgM/IgG-Antikörpers im ISF im Bereich von 1–6,4 µg/ml liegen, und es ist möglich, Ziel-IgM und IgG im ISF nachzuweisen, um die Blutentnahme zu ersetzen .

In dieser Studie haben wir einen neuartigen Patch-Sensor (Größe: 1,5 cm × 3,5 cm) entwickelt, der biologisch abbaubare poröse MNs und einen immunchromatographischen Assay (PMNIA) für den schnellen, schmerzlosen, einfach zu verwendenden und gleichzeitigen Nachweis von Anti-SARS-CoV-2 integriert IgM- und IgG-Antikörper in ISF. Die Innovation unseres neu entwickelten Geräts verkörpert sich in zwei Aspekten. Erstens gelang uns der Antikörpernachweis ohne Blutentnahme und wir schlagen einen neuen Ansatz zur Herstellung biologisch abbaubarer poröser MNs mit Emulsionströpfchen vor. Mikrokügelchen aus Polymilchsäure (PLA), die aus einer einzigen Emulsion hergestellt wurden, wurden zur Bildung kontinuierlicher Mikroporen verwendet und einer Wärmebehandlung unterzogen, um sie miteinander zu verbinden. Darüber hinaus stellten wir fest, dass die porösen MNs nach 30-minütigem Erhitzen auf 180 °C eine optimale Probenflüssigkeitsextraktion durch Kapillarwirkung und eine effektive Hautpenetration zeigten. Zweitens wurde ein neu gestalteter papierbasierter kolloidaler Gold-Immunoassay-Biosensor entwickelt. Beim Transport von den porösen MNs zur Biosensorplattform könnte das entnommene ISF durch Kapillarwirkung vertikal und autonom vom Probenpad (untere Schicht), dem Konjugatpad, der Nitrozellulosemembran (NC) (obere Schicht) und schließlich zum Absorptionspad fließen und der Antikörpertest wurde innerhalb von 3 Minuten durch visuelle Beobachtung der farbigen Banden abgeschlossen. Darüber hinaus betrug die Nachweisgrenze (LoD) des vorgeschlagenen Geräts 3 ng/ml für IgM und 7 ng/ml für IgG, was die Vorteile des schnellen Screenings auf COVID-19 gegenüber den aktuellen kommerziellen LFIAs zeigt.

Das Diagnosegerät bestand aus einem biologisch abbaubaren porösen MN-Array und einem neuartigen immunchromatographischen Biosensor aus kolloidalem Gold. Eine Strukturübersicht des zusammengebauten Geräts ist in Abb. 1a dargestellt. Es kann am vorderen Unterarm befestigt werden, der keine Körperbehaarung aufweist und die MN-Penetration erleichtert46. Darüber hinaus ermöglicht die Flexibilität des hergestellten porösen MN-Pflasters eine gute Anpassung an die Krümmung der menschlichen Haut. Kurz gesagt, das ISF wurde von porösen MNs extrahiert und in der Reihenfolge Probenpad, Konjugatpad und einem Ende der NC-Membran vertikal zum immunchromatographischen Biosensor transportiert und floss dann seitlich durch den gesamten NC-Membranstreifen, wo das Vorhandensein oder Fehlen von Anti-SARS-CoV-2-IgM/IgG wurde kolorimetrisch nachgewiesen und beobachtet.

Design von PMNIA zur COVID-19-Erkennung. (a) Foto einer Strukturübersicht des Detektionsgeräts und eine vergrößerte Ansicht des Geräts, bestehend aus dem porösen MN-Array und den Komponenten des papierbasierten immunchromatographischen Biosensors. Das eingefügte Bild zeigt das poröse MN-Array mit einem flexiblen Substrat. (b) Schematische Darstellung des PMNIA-Prinzips zum gleichzeitigen Nachweis von Anti-SARS-CoV-2-IgM/IgG. (c) Darstellung der Interpretation der unterschiedlichen Nachweisergebnisse mittels PMNIA.

Die poröse MN-Anordnung wurde aus PLA-Mikrokügelchen hergestellt, die in einer einzigen Emulsion hergestellt und anschließend einer Wärmebehandlung unterzogen wurden, um miteinander verbundene Mikroporen zu bilden, die ISF durch Kapillarwirkung absorbieren und transportieren. PLA ist ein Polymer mit guter Biokompatibilität und biologischer Abbaubarkeit, das den menschlichen Körper nicht schädigt und häufig in biomedizinischen Anwendungen eingesetzt wird47. Die Größe des porösen MN-Arrays betrug 1,5 cm × 1,5 cm, wobei die MNs auf einem Array von 13 × 13 ausgerichtet waren, um die ISF-Probe für die Biosensorik zu absorbieren. Das poröse MN-Array wurde dann an einer hydrophoben Membran (Dicke: 38 µm) mit einem Loch (1 cm × 1 cm) befestigt, um das entnommene ISF über Kapillarwirkung vom MN zum papierbasierten immunchromatographischen Assay zu transportieren verhindern, dass der Biosensor durch überschüssiges ISF durchnässt wird.

Der neu entwickelte immunchromatographische Biosensor besteht aus einem Probenpad, einem Konjugat-Freisetzungspad, einer NC-Membran mit einer transparenten Verpackungsfolie aus Polyethylenterephthalat (PET) auf der Rückseite und einem Absorptionspad. Das Probenpad wurde auf einer gestanzten hydrophoben Membran befestigt und zur anschließenden Probenentnahme mit dem Substrat des porösen MN-Arrays verbunden. Hier weist das SARS-CoV-2-Spike-Protein RBD, das das wichtigste Immunogen zur Induktion der Antikörperproduktion gegen COVID-1948 ist, eine hohe Spezifität für die Bindung von Anti-SARS-CoV-2-IgM/IgG-Antikörpern auf49. Das Spike-Protein RBD wurde an kolloidale AuNPs konjugiert, auf das vorbehandelte Konjugatpad verteilt und schließlich oben auf dem Probenpad befestigt. Als nächstes wurde der NC-Membranstreifen auf das Konjugatpad gelegt. Anti-Human-IgM- und IgG-Antikörper (monoklonale Maus) wurden auf den IgM- bzw. IgG-Testlinien der NC-Membran immobilisiert, um die Immunkomplexe einzufangen, in denen SARS-CoV-2 RBD-konjugierte AuNPs anreichert, die an Anti-SARS-CoV gebunden sind -2 IgM/IgG-Antikörper. Kaninchen-IgG-konjugierte AuNPs wurden hergestellt und auf dasselbe Konjugatpad aufgetragen, um von einem Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper eingefangen zu werden, der als Kontrolllinie auf der NC-Membran immobilisiert war. Am distalen Ende des NC-Membranstreifens wurde ein Absorptionspad angebracht, um überschüssiges ISF zu absorbieren und den kontinuierlichen Probenfluss aufrechtzuerhalten. Die endgültige Größe des Diagnosegeräts nach dem Zusammenbau betrug 1,5 cm × 3,5 cm und das Material und die Größe jedes funktionalisierten „Papiers“ sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Das Prinzip des COVID-19-Diagnosegeräts ist in Abb. 1b dargestellt. Nach dem Eindringen in die menschliche Haut extrahiert das poröse MN-Array ISF und transportiert es mittels Kapillarwirkung durch kontinuierliche Mikroporen zum Substrat. Anschließend wird das extrahierte ISF vom Probenpad absorbiert und vertikal zum Konjugatpad bewegt, das sich über dem Probenpad befindet. Wenn Anti-SARS-CoV-2-IgM- und IgG-Antikörper im entnommenen ISF vorhanden sind, würden sie die auf dem Konjugatpad verteilten RBD-markierten AuNPs des SARS-CoV-2-Spike-Proteins binden. Die AuNP-Antikörper-Konjugate wandern vertikal zur NC-Membran. Da die NC-Membran dem Konjugatpad zugewandt ist, fließen die Konjugate weiterhin seitlich durch den gesamten Streifen. Anschließend werden Anti-SARS-CoV-2-IgM-Antikörper von auf der IgM-Linie immobilisierten Anti-Human-IgM-Antikörpern eingefangen, während Anti-SARS-CoV-2-IgG-Antikörper von auf der IgG-Linie immobilisierten Anti-Human-IgG-Antikörpern eingefangen werden. Das Vorhandensein von Anti-SARS-CoV-2-IgM- und IgG-Antikörpern wird durch farbige Linien angezeigt, die durch die transparente PET-Verpackungsfolie hindurch lesbar sind. Wenn das entnommene ISF keine spezifischen Antikörper gegen SARS-CoV-2 enthält, werden keine Immunkomplexe gebildet und daher werden keine kolorimetrischen Markierungen beobachtet. Überschüssige mit Kaninchen-IgG konjugierte AuNPs werden durch den auf der Kontrolllinie immobilisierten Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper eingefangen. Das Erscheinen einer farbigen Kontrolllinie zeigt an, dass das entnommene ISF durch den Immunoassay gewandert ist und das Gerät optimal funktioniert hat. Schließlich wird die verbleibende Flüssigkeit durch Kapillarkraft vom Absorptionskissen gesammelt, wodurch ein ausreichendes Bettvolumen für den vollständigen Fluss der entnommenen ISF bereitgestellt wird. Wie in Abb. 1c dargestellt, können die Nachweisergebnisse ausgelesen und wichtige Informationen über den Verlauf der COVID-19-Infektion gewonnen werden.

In mehreren Studien wurden die Herstellungsmethoden zur Herstellung poröser MNs durch Porogenauslaugung untersucht31,32,33,50. Der Auslaugungsprozess dauert jedoch relativ lange und die für die MN-Herstellung verwendeten Materialien sind begrenzt, da eine ausreichende mechanische Festigkeit gewährleistet sein sollte, insbesondere nach der Entfernung von Porogenen. In dieser Studie wurde ein neuer Ansatz zur direkten Herstellung poröser Mikrostrukturen innerhalb von MNs mit Emulsionströpfchen vorgeschlagen. Hier wurde PLA, ein biologisch abbaubares Polymer, das aus erneuerbaren Ressourcen51 hergestellt wird, zur Herstellung von Mikrokügelchen verwendet. Mit einer einzigen Emulsion hergestellte PLA-Mikrokügelchen wurden verwendet, um direkt miteinander verbundene Mikroporen innerhalb der MNs zu bilden (Abb. 2a), gefolgt von einer Wärmebehandlung, um sie miteinander zu verbinden und die porösen Strukturen zu stabilisieren. Der Durchmesser der hergestellten Mikrokügelchen betrug 15,5 ± 6,9 μm, bestimmt durch optische Mikroskopie (Abb. 2b). Anschließend wurde die vorbereitete Lösung in die MN-Matrize gegossen und nach dem Trocknen und Abziehen wurden poröse MNs erhalten. Nach einer Wärmebehandlung bei vier verschiedenen Temperaturen (170 °C, 180 °C, 190 °C und 200 °C) wurden die Formen und Abmessungen des porösen PLA MN gemessen. Wie in Abb. 2c angegeben, blieb die Form der MNs nach der Wärmebehandlung erhalten (MNs nach 30-minütiger Wärmebehandlung bei 170 ° C, 190 ° C und 200 ° C sind in Abb. S1 dargestellt), während sich ein Unterschied in der Farbe ergab der porösen MNs wurde vor und nach der Wärmebehandlung beobachtet. Wir bestätigten, dass die Farbänderung auf PVA zurückzuführen war, das als Tensid verwendet wurde, indem wir hergestellte PLA-MNs mit MNs verglichen, die nur aus 5 % (Gew./Vol.) PVA hergestellt wurden (Abb. S2a). Während der Wärmebehandlung führten die in den makromolekularen PVA-Ketten gebildeten Polyenanteile zu einer allmählichen Verschiebung der Wellenlänge hin zu einer längeren Wellenlänge52. Daher zeigte das gesamte MN im Vergleich zu den MNs vor der Wärmebehandlung eine gelbbraune Färbung nach der Wärmebehandlung. Darüber hinaus wurde aufgrund der Ergebnisse mit verschiedenen PVA-Lösungen angenommen, dass PVA zwei Rollen bei der Bildung poröser PLA-MNs spielt (Abb. S2b). Eines davon ist ein Tensid, das während des Einzelemulsionsprozesses PLA-Mikrokügelchen bildet. Die andere besteht darin, die Form von MNs während des Formprozesses beizubehalten. Was die Abmessungen der hergestellten MNs betrifft, so nahmen sowohl die Höhe als auch die Breite der MN-Basis nach der Wärmebehandlung leicht ab (Abb. 2d). Diese Schrumpfung könnte auf das Schmelzen und Verkleben der PLA-Mikrokügelchen innerhalb der MN-Strukturen zurückzuführen sein.

Herstellung poröser PLA-MNs mit Emulsionströpfchen. (a) Zur Herstellung von PLA-Mikrokügelchen wurde eine einzelne Emulsion verwendet, gefolgt von einer Wärmebehandlung zum Schmelzen und Verbinden der Mikrokügelchen, um miteinander verbundene Mikroporen zu bilden. (b) Hergestellte PLA-Mikrokügelchen, abgebildet durch optische Mikroskopie. (c) Poröses PLA-MN-Array vor (links) und nach der Behandlung (rechts) bei 180 °C für 30 Minuten. (d) Abmessungen poröser PLA MNs nach der Wärmebehandlung (n = 5).

Der Einfluss der zur Wärmebehandlung verwendeten Temperatur auf die Bildung poröser Strukturen im Inneren der MNs wurde mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM) untersucht. Die Struktur- und Querschnittsbilder eines einzelnen MN sind in Abb. 3a dargestellt. Nachdem die PLA-Mikrokügelchen in den Hohlraum der MN-Form gefüllt und 2 Stunden lang bei 50 °C getrocknet wurden, bildeten sich durchgehende Hohlräume zwischen den PLA-Mikrokügelchen, die nicht miteinander verbunden waren. Nach einer 30-minütigen Wärmebehandlung bei 170 °C (Schmelzpunkt von PLA) begann ein Teil der Mikrokügelchen zu schmelzen und sich miteinander zu verbinden. Bei einer Temperatur von 180 °C verbanden sich die meisten Mikrokügelchen miteinander, was zur Bildung mikrometergroßer, miteinander verbundener Poren führte. Im Gegensatz dazu waren die Mikrokügelchen überschmolzen und nur wenige miteinander verbundene Hohlräume wurden bestätigt, als PLA-MNs auf 200 °C erhitzt wurden. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Wärmebehandlungstemperatur das Schmelzen und Verkleben von PLA-Mikrokügelchen sowie die Bildung poröser Strukturen erheblich beeinflusst.

Poröse Struktur und Flüssigkeitsaufnahme von MNs nach Wärmebehandlung. (a) REM-Bilder einer einzelnen MN-Struktur und ihres Querschnitts. (b) Porosität poröser MNs, bestimmt durch die Wasseraufnahmemethode. (c) Das absorbierte Volumen der Probenflüssigkeiten aus 1 % (w/v) Agarosegel nach 1 Minute und 2 Minuten (n = 4).

Als nächstes wurde die Porosität poröser PLA-MNs mithilfe der Wasseraufnahmemethode gemessen (Abb. 3b). Vor der Wärmebehandlung betrug die Porosität 27,2 ± 0,9 %. Mit zunehmender Temperatur für die Wärmebehandlung nahm die Porosität allmählich ab, da mehr PLA-Mikrokügelchen schmolzen und sich verklebten, was zur Verringerung durchgehender Hohlräume im Inneren der MNs beitrug. Anschließend wurde die Absorptionsfähigkeit der hergestellten porösen PLA-MNs nach der Wärmebehandlung untersucht. Zur Nachahmung menschlicher Haut wurde Agarosegel (1 %, w/v) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), bedeckt mit Aluminiumfolie, verwendet. Auf das MN-Array wurde eine Kraft von 5 N ausgeübt, um das Hautmodell zu durchdringen. Nach einer Wärmebehandlung bei 170–200 °C durchdrangen MNs erfolgreich die Aluminiumfolie und absorbierten die Probenflüssigkeit aus dem Agarosegel. Allerdings drangen die bei 50 °C getrockneten MNs in die Aluminiumfolie ein, konnten die MN-Struktur jedoch nicht aufrechterhalten, und die meisten PLA-Mikrokügelchen der MNs kollabierten und verblieben im Agarosegel. Dies wurde auf die mangelnde Haftung zwischen den Mikrokügelchen innerhalb der MNs zurückgeführt. Die Absorptionsvolumina der Probenflüssigkeiten für 1 Minute und 2 Minuten sind in Abb. 3c dargestellt. Auf 180 °C erhitzte MNs hatten innerhalb von 2 Minuten das höchste Absorptionsvolumen an Probenflüssigkeit, wodurch 109,8 ± 8,7 μl Probenflüssigkeit aus dem menschlichen Hautmodell extrahiert wurden. Da die menschliche Haut einen geringeren Wassergehalt zwischen 58 und 72 % aufweist53 im Vergleich zu 1 % Agarosegel mit 99 % Pufferlösung, können die bei 180 °C wärmebehandelten porösen MNs theoretisch innerhalb von 2 Jahren 64,4–79,8 μL aus der menschlichen Haut extrahieren Mindest. Unter der Annahme, dass die extrahierte Flüssigkeit nicht in die NC-Membran eindringen und über Kapillarwirkung durch den Streifen fließen kann, bis das Probenpad und das Konjugatpad mit der extrahierten Flüssigkeit gesättigt sind, sind theoretisch mindestens 63,7 μL ISF die notwendige Absorptionsmenge aus der menschlichen Haut (berechnet). (aus der Gesamtgröße von Probenpad und Konjugatpad und der Aufnahmerate des verwendeten Glasfaserpads, die 50,9 μL/cm2 beträgt). Daher konnte das poröse PLA-MN-Array, das einer 30-minütigen Wärmebehandlung bei 180 °C unterzogen wurde, ausreichend ISF für die anschließende Immunoassay-Biosensorik extrahieren.

Die mechanische Festigkeit der porösen PLA-MNs nach der Wärmebehandlung wurde gemessen und analysiert, indem axiale Kompressionstests unter Verwendung einer Kraft-Weg-Teststation durchgeführt wurden (Abb. 4a). Wie in Abb. 4b gezeigt, betrug die durchschnittliche Bruchkraft von getrocknetem porösem PLA MN vor der Wärmebehandlung 0,13 ± 0,02 N, wohingegen die durchschnittliche Bruchkraft von porösem PLA MN nach der Wärmebehandlung bei 170 °C, 180 °C und 190 °C betrug C und 200 °C für 30 Minuten betrugen 0,59 ± 0,08 N, 0,93 ± 0,11 N, 1,12 ± 0,14 N bzw. 1,19 ± 0,13 N. Die repräsentativen Kraft-Weg-Kurven der porösen MNs vor und nach der Wärmebehandlung sind in Abb. S3 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass poröse PLA-MNs über eine ausreichende mechanische Festigkeit (> 0,058 N) für Hautpunktionen verfügten, unabhängig von der Temperatur, bei der die Wärmebehandlung durchgeführt wurde54. Darüber hinaus konnte der Elastizitätsmodul (E) poröser PLA-MNs auf der Grundlage der MN-Abmessungen und der Ergebnisse der Versagenskräfte berechnet werden (Gleichung (2)). Der Elastizitätsmodul der porösen MNs stieg deutlich von 120,7 ± 18,2 MPa vor der Wärmebehandlung auf 908,7 ± 26,4 MPa nach einer 30-minütigen Wärmebehandlung bei 180 °C, und die mechanische Festigkeit der porösen MNs nahm bei höherer Heiztemperatur aufgrund von mehr PLA-Mikrokügelchen zu Schmelzen und Verkleben innerhalb der MN-Strukturen (Abb. 4b).

Bewertung der mechanischen Eigenschaften und der Hauteinfügung poröser MNs. (a) Eine schematische Darstellung eines mechanischen Kompressionstestaufbaus mit einem axial beweglichen Kraftsensor und optischen Mikroaufnahmen von porösen MNs, die vor und nach einem axialen Versagenstest bei 180 °C wärmebehandelt wurden. Maßstabsbalken, 500 μm. (b) Bruchkraft und berechneter Elastizitätsmodul poröser MNs nach Wärmebehandlung bei verschiedenen Temperaturen. (c) Penetrationseffizienz poröser PLA-MNs nach Wärmebehandlung bei verschiedenen Temperaturen. Das eingefügte Bild zeigt die Einfügung poröser MNs nach einer Wärmebehandlung bei 180 °C in die mit Methylenblau gefärbte Schweinehaut. Maßstabsleiste, 5 mm. (d) Einsetzen der Rattenhaut und ISF-Extraktion unter Verwendung poröser MNs, die mit einem glukoseempfindlichen Papier und einem leeren Papier befestigt sind. Die Rückenhaut der Ratte wurde auf einer 3D-gedruckten Plattform für die MN-Insertion fixiert (d1) und die Bilder zeigten die ISF-Extraktion durch poröse MNs und die Bewegung zu den angebrachten Papieren innerhalb von 5 Minuten (d2) sowie die Erholung der Rattenhaut im Laufe der Zeit nach der Entfernung das MN-Array (d3). Maßstabsleiste, 5 mm.

Als nächstes wurde ein Einführtest mit Schweinehaut durchgeführt, um zu validieren, ob poröse PLA-MNs ausreichend steif waren, um die Haut zu durchstechen. Die Ergebnisse zeigten, dass poröse MNs die Schweinehaut unabhängig von der Wärmebehandlung erfolgreich durchbohrten (Abb. S4). Während sich das MN-Pflaster ohne Wärmebehandlung nach dem Einsetzen von der Schweinehaut ablöste, blieb jedoch nicht die gesamte Struktur des MN-Pflasters erhalten und löste sich schließlich ab (Abb. S4a). Dies lag daran, dass die PLA-Mikrokügelchen im gesamten MN-Pflaster nicht aneinander hafteten, was dazu führte, dass das Pflaster beim manuellen Auftragen zusammenfiel und sich schließlich ablöste, als es von der Schweinehaut abgezogen wurde. Im Gegensatz dazu gelang es den meisten MNs, die einer Wärmebehandlung oberhalb der Schmelztemperatur unterzogen wurden, erfolgreich in die Haut einzudringen (Abb. S4b – d). Die Ergebnisse der Penetrationseffizienz (PE) von porösen PLA-MNs nach der Wärmebehandlung sind in Abb. 4c dargestellt. Der PE von porösen MNs stieg nach der Wärmebehandlung im Vergleich zu dem von porösen MNs vor der Wärmebehandlung deutlich an. Darüber hinaus zeigten die MNs nach einer Wärmebehandlung bei 180–200 °C vergleichbare PEs, was darauf hindeutet, dass eine ausreichende Haftung geschmolzener PLA-Mikrokügelchen, die auf Temperaturen über 180 °C erhitzt wurden, den MNs eine ausreichende mechanische Festigkeit verleiht, um die Haut zu durchstechen und ihre Struktur nach dem Eindringen beizubehalten.

Basierend auf In-vitro-Ergebnissen führten wir einen In-vivo-Test durch, bei dem ein poröser MN-Array, der bei 180 °C wärmebehandelt wurde, mit Daumenkraft auf die Rückenhaut einer lebenden Ratte aufgebracht wurde. Um zu überprüfen, ob die hergestellten MNs extrahieren können, wurden ein glukoseempfindlicher Papierbiosensor31 und ein leeres Papier mit transparentem Klebeband am porösen MN-Array befestigt, wie in Abb. 4d1 und Abb. S5 gezeigt. Nach 5-minütiger MN-Insertion wurde die Körperflüssigkeit von MNs extrahiert und in das leere Papier sowie den glukoseempfindlichen Papierbiosensor infiltriert (Abb. 4d2). Außerdem wurden mit bloßem Auge eine kolorimetrische Reaktion und eine blaue Farbentwicklung des Biosensors aufgrund der Oxidation von 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin (TMB) beobachtet, das als chromogener Farbstoff verwendet wurde (Abb. S5c), was auf den Körper hinweist Glucose enthaltende Flüssigkeit wurde extrahiert und durch Kapillarwirkung der porösen MN-Strukturen und -Papiere über MNs zu den angebrachten Papieren transportiert. Nach der Entfernung der MNs wurde auch die Hauterholung nach der MN-Behandlung untersucht. Wie in Abb. 4d3 dargestellt, waren auf der Hautoberfläche der Ratte Mikrolöcher markiert, die MN-Einfügungsstellen entsprachen und sich allmählich zusammenzogen, was auf eine schnelle Hauterholung sowie eine geringere Hautschädigung nach der MN-Anwendung hindeutet. Anschließend wurde die vorbereitete Luminollösung im Dunkeln auf das leere Papier gesprüht, um zu bestätigen, ob Blut in der extrahierten Flüssigkeit vorhanden war (Abb. S5d2). Infolgedessen wurde keine Chemilumineszenzreaktion sichtbar (Abb. S6), was darauf hindeutet, dass die hergestellten MNs innerhalb von 5 Minuten in die Rattenhaut eindringen und den dermalen ISF zur Sensorschicht extrahieren konnten.

Wie in Abb. 5a, b gezeigt, wurden das poröse MN-Array, das vorbereitete Probenpad, das Konjugatpad, die NC-Membran, das Absorptionspad und die gestanzte hydrophobe Membran zusammengesetzt und das PMNIA gebildet. Das poröse MN-Array wurde mit einem doppelseitigen Klebeband auf einer Seite der hydrophoben Membran befestigt und der vorbereitete Immunoassay wurde auf der anderen Seite befestigt. Anschließend wurde an beiden Enden der NC-Membran transparentes einseitiges Klebeband angebracht, um die Immunoassay-Struktur zu fixieren.

Zusammenbau des PMNIA als Anti-SARS-CoV-2-Antikörper-Nachweispflaster, seine Fähigkeit zur Flüssigkeitsextraktion und vollständige Durchflusstestzeit. (a) Bild des zusammengebauten Detektionspflasters mit integrierten porösen MNs und papierbasiertem Immunoassay-Biosensor. Maßstabsleiste, 5 mm. (b) Komponenten der PMNIA-Baugruppe. (c) Darstellung des auf das Hautmodell aufgetragenen PMNIA und aufeinanderfolgende Standbilder, die die Extraktion der Probenflüssigkeit durch poröse MNs und den Transport durch den gesamten Immunoassay-Biosensor zeigen, was zur Entwicklung einer rötlich-violetten Farbe auf der Kontrolllinie führt. Die Anwendungszeit wird in den oberen linken Ecken angezeigt. „c“ in Rot steht für die Kontrolllinie. Maßstabsleiste, 5 mm.

Anschließend wurde die Zeit, die für den vollständigen Durchfluss des Erkennungspflasters erforderlich ist, am menschlichen Hautmodell getestet. Das MN-Array wurde manuell auf das Hautmodell aufgebracht und die Probenflüssigkeit wurde durch poröse MNs extrahiert und transportiert. Kurz darauf wurde das Konjugatpad von der Flüssigkeit benetzt, die durch Kapillarwirkung vom Probenpad vertikal nach oben transportiert wurde, und markierte AuNPs wurden vom Konjugatpad an die NC-Membran abgegeben (Abb. 5c). Die Ergebnisse zeigten, dass die Probenflüssigkeit innerhalb von 1 Minute schnell vom MN-Array extrahiert wurde und anschließend zum Probenpad floss. Nach 3 Minuten floss die Probenflüssigkeit durch den NC-Membranstreifen und erreichte das Absorptionskissen. Darüber hinaus zeigte die rötlich-violette Farbe der Kontrolllinie den Punkt an, an dem die Kaninchen-IgG-konjugierten AuNPs die Kontrolllinienzone passierten und an Anti-Kaninchen-IgG gebunden wurden. Somit betrug die Gesamtzeit, die für die Flüssigkeitsextraktion und ihren vollständigen Fluss durch das gesamte Nachweisfeld mit visueller Bestätigung des Ergebnisses erforderlich war, 3 Minuten. Darüber hinaus wurde das Absorptionskissen 8 Minuten lang durchnässt, wobei die Kontrolllinie deutlich sichtbar war.

Die Leistung des Anti-SARS-CoV-2-IgM/IgG-Nachweispflasters wurde anhand von vier Einzelmessungen bewertet. ISF-Simulant (PBS-Puffer) mit 0,5 µg/ml Anti-SARS-CoV-2-IgM-Antikörper, 0,5 µg/ml Anti-SARS-CoV-2-IgG-Antikörper, einer Mischung aus 0,5 µg/ml Anti-SARS-CoV-2-IgM und Es wurden eine IgG-Antikörperlösung und eine PBS-Lösung als Kontrolle hergestellt und 80 µL jeder Lösung auf das poröse MN-Array der Nachweisgeräte pipettiert. Wie in Abb. 6a1–a3 dargestellt, deuten die Ergebnisse darauf hin, dass bei Vorliegen SARS-CoV-2-spezifischer Antikörper in der Probe eine rot-violette Farbe auf der Testlinie erscheinen würde. Waren dagegen keine SARS-CoV-2-spezifischen Antikörper in der Probe vorhanden, wurde kein Immunkomplex an den Testlinien gebunden; Allerdings war die Kontrolllinie rot/violett gefärbt, was darauf hinweist, dass die Flüssigkeit ausreichend entlang des Geräts floss, wie in Abb. 6a4 dargestellt. Wenn die Probe außerdem nur Anti-SARS-CoV-2-IgM- oder IgG-Antikörper enthielt, erschienen die IgM- bzw. IgG-Linien jeweils rot/lila, wohingegen sowohl IgM- als auch IgG-Linien rot/lila erschienen, wenn die Mischung aus Anti-SARS-CoV -2 IgM- und IgG-Antikörperlösung wurde aufgetragen. Alle vier Einzelmessungen wurden dreimal durchgeführt. Darüber hinaus konnten alle Testergebnisse innerhalb von 3 Minuten beobachtet werden, was auf einen schnellen Nachweis von Anti-SARS-CoV-2-IgM/IgG-Antikörpern mit diesem neuartigen Pflaster schließen lässt.

Nachweis von SARS-CoV-2-spezifischen IgM/IgG-Antikörpern mittels pflasterintegrierter poröser MNs und papierbasierter Immunoassays sowie deren Empfindlichkeit. (a) Visuelle Testergebnisse einer ISF-Probe, die IgM (a1), IgG (a2), eine Mischung aus IgM und IgG (a3) ​​und eine Blindkontrolle (a4) enthält. Maßstabsleiste, 5 mm. (b) Nachweis von Anti-SARS-CoV-2-IgM (b1) und IgG (b2) in unterschiedlichen Konzentrationen. (c) Die durchschnittliche Farbintensität der IgM-Linie (c1) und der IgG-Linie (c2) und ihre angepassten Kurven. Die Diagramme wurden durch Analyse von drei unabhängigen Nachweisfeldern (n = 3) für jede Zielkonzentration erstellt und die angepassten Kurven entsprechen der folgenden Gleichung: y = Start + (Ende – Start) × xn/(kn + xn). Für den IgM-Nachweis (c1): Start = 8,29 ± 0,29, Ende = 63,24 ± 3,12, k = 1801,30 ± 732,86, n = 0,76 ± 0,09 mit R2 = 0,998; Für den IgG-Nachweis (c2): Start = 2,54 ± 0,43, Ende = 157,29 ± 33,49, k = 1322,64 ± 534,49, n = 1,12 ± 0,11 mit R2 = 0,993.

Als nächstes wurde die Empfindlichkeit des neuartigen Immunoassays anhand serieller Verdünnungen von Anti-SARS-CoV-2-IgM- und IgG-Antikörperproben zum Nachweis untersucht. Die Probenlösungen mit IgM- und IgG-Antikörpern wurden im Bereich von 0,1–10 µg/ml hergestellt und dann wurden 80 µL jeder Probenlösung für die Analyse verwendet. Abbildung 6b1 zeigt das Bild des COVID-19-Nachweisgeräts, das verschiedene Konzentrationen von Anti-SARS-CoV-2-IgM-Antikörpern (0,1–10 µg/ml) testet. Die Ergebnisse zeigten, dass mit abnehmender IgM-Konzentration die rötlich-violette Farbe auf der IgM-Linie schwächer wurde, da weniger SARS-CoV-2-Spike-RBD-AuNPs-IgM-Immunkomplexe gebildet und auf den IgM-Linien abgefangen wurden. Die Testergebnisse verschiedener Konzentrationen von Anti-SARS-CoV-2-IgG-Antikörpern (0,1–10 µg/ml) sind in Abb. 6b2 dargestellt. Dies zeigte auch, dass die Farbintensität positiv mit der IgG-Konzentration korrelierte.

Anschließend wurde die LoD für Anti-SARS-CoV-2-IgM/IgG-Antikörper nach dem Testen verschiedener Konzentrationen (10–0,1 ng/ml) berechnet und die Sigmoidkurven sind in Abb. 6c1, c2 dargestellt. Die LoD für IgM- und IgG-Antikörper betrug 3 ng/ml bzw. 7 ng/ml, berechnet mit der IUPAC-Standardmethode (LoD = Mittelwert der Blindkontrolle + dreifache Standardabweichung der Blindkontrolle)55. Die Ergebnisse legen nahe, dass das entwickelte neuartige Pflaster eine hohe Empfindlichkeit für SARS-CoV-2-IgM/IgG-Antikörper aufwies, die mit der von kommerziellen LFIA-Streifen vergleichbar oder höher war56,57.

Aktuelle Nachweismethoden für COVID-19, wie etwa RT-PCR, erfordern teure Laboreinrichtungen, geschulte Labortechniker und lange Bearbeitungszeiten, was in Entwicklungsländern mit begrenzten Ressourcen ein Massenscreening und die Identifizierung infizierter Personen erschwert. Eine andere Methode besteht darin, SARS-CoV-2-spezifisches IgM/IgG mit LFIA als ergänzendes Tool zu testen, um eine kürzliche oder frühere Infektion zu erwarten und vermutete COVID-19-Fälle mit negativen RT-PCR-Ergebnissen zu bestätigen. Allerdings verursacht die Blutentnahme Schmerzen beim Probanden und kann zu einer Infektion an der Einstichstelle führen. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, haben wir eine neuartige Patch-Methode zum Nachweis von COVID-19 entwickelt, indem wir poröse MNs und einen neuen immunchromatographischen Assay integriert haben. Das vorgeschlagene Gerät ermöglicht den minimalinvasiven und schnellen Nachweis von SARS-CoV-2-spezifischen IgM/IgG-Antikörpern durch die Entnahme von ISF anstelle von Blut. Darüber hinaus kann das COVID-19-Erkennungspflaster ohne die Hilfe von medizinischem Personal selbst angebracht werden.

Derzeit konzentrieren sich die bestehenden Arbeiten zu MNs für die ISF-Extraktion und die anschließende Biosensorik hauptsächlich auf hohle oder quellbare MNs. Hohle MNs bestehen jedoch häufig aus Metall oder nicht biologisch abbaubaren Polymeren, die der menschlichen Gesundheit schaden können, und quellbare MNs erfordern einen aufwändigen Prozess zur Rückgewinnung extrahierter Analyten42. Obwohl poröse MNs diese Probleme lösen können, stellen sie im Gegensatz dazu Herausforderungen durch komplizierte und zeitaufwändige Herstellungsprozesse dar. Daher schlagen wir einen neuartigen und einfachen Herstellungsprozess für poröse MNs vor, die aus biologisch abbaubaren PLA-Mikrokügelchen bestehen. Die miteinander verbundenen Mikroporen wurden direkt durch die Hohlräume zwischen den PLA-Mikrokügelchen gebildet, die anschließend wärmebehandelt wurden. Durch die Wärmebehandlung schmolzen die Mikrokügelchen und verbanden sich miteinander, was zu stabilen und robusten porösen Strukturen führte. Der Vorteil der vorgeschlagenen Herstellungsmethode besteht darin, dass nach der Bildung von PLA-Mikrokügelchen die Kugelform in einer Umgebungsumgebung stabil beibehalten werden kann und sie darüber hinaus für die Produktion in größerem Maßstab geeignet sind. Die optimale Temperatur für die Wärmebehandlung betrug 180 °C und das Absorptionsvolumen der Probenflüssigkeit (110 µL/Array in 2 Minuten) deutete auf eine ausreichende Absorptionsfähigkeit für die Biosensorik hin.

Darüber hinaus haben wir unter Ausnutzung der ISF-Extraktion in vertikaler Richtung über Kapillarwirkung einen papierbasierten Immunoassay in einer neuen Struktur entworfen und entwickelt, der vertikale und laterale Flussstrukturen umfasst, um zu porösen MN-Arrays zu passen und die Visualisierung immunchromatographischer Ergebnisse zu ermöglichen. Darüber hinaus betrug die Länge der NC-Membran 2 cm, um die ISF-Flussstrecke zu verkürzen, und die Nachweiszeit betrug 3 Minuten. Im Vergleich dazu erfordern kommerzielle LFIAs für IgM/IgG-Antikörpertests eine Blutentnahme, Pufferabgabe und eine Wartezeit von 15 Minuten. Daher ist unser Erkennungspflaster kompakt, einfach zu verwenden und liefert zuverlässige Ergebnisse in vergleichsweise kürzerer Zeit.

Darüber hinaus betrug die Empfindlichkeit (LoD) von PMNIA 3 ng/ml für den IgM-Nachweis und 7 ng/ml für den IgG-Nachweis, was besser ist als die einiger aktueller kommerzieller AuNP-basierter LFIA-Kits zum Nachweis von SARS-CoV-2-spezifisch Antikörper58. Daher ermöglichte die entwickelte PMNIA einen genaueren Nachweis von SARS-CoV-2-spezifischen IgM/IgG-Antikörpern und reduzierte die Falsch-Negativ-Rate. Obwohl SARS-CoV-2-spezifische Antikörper in dermalem ISF nicht umfassend untersucht wurden, haben frühere Studien zur proteomischen Analyse von Körperflüssigkeiten berichtet, dass ISF im Vergleich zu Plasma und Serum sehr homogen und hinsichtlich der Proteinvielfalt, einschließlich Immunglobulinen, identisch ist59, 60. Daher gehen wir davon aus, dass die Anti-SARS-CoV-2-IgM/IgG-Antikörperspiegel im ISF gut mit denen im Blut korrelieren und mit der vorgeschlagenen PMNIA nachgewiesen werden könnten. Zukünftig wird die klinische Validierung des entwickelten Patch-Sensors an infizierten und nicht infizierten, nicht geimpften Personen durchgeführt, um die Spezifität und Sensitivität im Vergleich zur RT-PCR als Goldstandard für die klinische Diagnose von COVID-1920 zu untersuchen. Außerdem wird der Vergleich der Nachweisleistung des neuen Geräts mit kommerziell erhältlichen LFAs anhand von Blutproben und ISF-Proben durchgeführt. Man geht davon aus, dass das minimalinvasive, einfache und schnelle Erkennungspflaster große Aussichten für die Erkennung von Protein-Biomarkern bei ISF und der Diagnose anderer Infektionskrankheiten bietet und in medizinischen Umgebungen mit begrenzten medizinischen Ressourcen umfassend eingesetzt werden kann.

In dieser Studie wurde ein neuartiges COVID-19-Diagnosegerät vom Patch-Typ, PMNIA, entwickelt, das poröse MNs und einen immunchromatographischen Biosensor integriert. Eine einfache und neuartige Herstellungsmethode für biologisch abbaubare poröse PLA-MNs durch Emulsions- und Wärmebehandlung wurde optimiert, um die beste Absorptionsfähigkeit und ausreichende mechanische Festigkeit zum Durchstechen der Rückenhaut von Schweinen und Ratten zu erreichen. Die Struktur des papierbasierten Immunoassays wurde mit vertikalem und seitlichem Fluss entworfen, um eine kontinuierliche Probenahme vom MN-Array zum Immunoassay-Biosensor zu ermöglichen und eine klare Visualisierung der Nachweisergebnisse mit bloßem Auge zu ermöglichen. An einer Modellhaut wurde ein In-vitro-Test durchgeführt, bei dem das Pflaster auf Agarosegel aufgetragen wurde. Die Ergebnisse wurden innerhalb von 3 Minuten an der Kontrolllinie beobachtet. Darüber hinaus zeigte die LoD für den Nachweis von SARS-CoV-2-spezifischen Antikörpern eine hohe Empfindlichkeit im Vergleich zu kommerziellen LFIAs. Wir gehen davon aus, dass Menschen mit diesem neu strukturierten Immunoassay IgM- und IgG-Antikörper gegen SARS-CoV-2 schmerzlos und schnell nachweisen können. Darüber hinaus ist die kompakte Größe des integrierten Diagnosegeräts sowohl für Ärzte als auch für Patienten von Vorteil. Darüber hinaus bietet das vorgeschlagene Gerät ein großes Potenzial für ein schnelles Screening verschiedener Arten von Infektionskrankheiten als wirksame Ergänzungsmethode zu anderen diagnostischen Tests.

Für die Herstellung und Bewertung der porösen PLA MNs wurde PLA (Ingeo 4032D) von NatureWorks (Minneapolis, MN, USA) bezogen. Dichlormethan (135-02446), Trehalose-Dihydrat (202-18452), Luminol (123-02583) und Wasserstoffperoxid (081-04215) wurden von Fujifilm Wako Pure Chemical (Osaka, Japan) bezogen. Es wurden Poly(vinylalkohol) (363103), Methylenblau (M9140), Peroxidase aus Meerrettich (SRE0082), 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin (860336), Glucoseoxidase (G7141) und Natriumcarbonat (V800370) erhalten von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Polydimethylsiloxan (PDMS)-Vorpolymer und Härter (Silpot 184) wurden von Dow Chemical Company (Midland, MI, USA) bezogen. Agarosegel (NE-AG01) wurde von Nippon Genetics (Tokio, Japan) gekauft. Isofluran wurde von Pfizer (New York, NY, USA) bezogen. Enthaarungscreme (LBS-s, Veet) wurde von Reckitt Japan (Tokio, Japan) gekauft.

Für die Vorbereitung des papierbasierten Immunoassays wurden das Probenpad, das Konjugatpad (Standard 14), die NC-Membran (FF120 HP Plus) und das Absorptionspad (CF4) von Whatman (Maidstone, UK) erworben. Hydrophobe Membranen wurden von LINTEC Co. (Tokio, Japan) bezogen. Goldkolloide (AuH2, 40 nm) wurden von Morinaga (Yokohama, Japan) bezogen. Der Boratpuffer wurde von Fujifilm Wako Pure Chemical bezogen. SARS-CoV-2-Spike-Protein RBD (C19SD-G241H), Anti-SARS-CoV-2-Spike-Protein-hIgM-Antikörper (G19S1-M60H), Anti-SARS-CoV-2-Spike-Protein-hIgG-Antikörper (G19S1-60H), Maus-Antikörper -Der monoklonale humane IgM-Antikörper (H38M-60M-1000) und der monoklonale Anti-human-IgG-Antikörper der Maus (H38-60M-1000) wurden von SignalChem (Richmond, Kanada) erworben. Kaninchen-IgG-Antikörper (I8140), Rinderserumalbumin (BSA, A7030) und Polyoxyethylen(20)-sorbitanmonolaurat (Polysorbat 20 oder Tween-20, P1379) wurden von Sigma-Aldrich erworben, und Anti-Kaninchen-IgG (H + L) Der Antikörper wurde von Funakoshi (Tokio, Japan) erhalten. PBS wurde von Nacalai Tesque (Kyoto, Japan) bezogen.

Die männliche Form aus MN-Edelstahl wurde zunächst mithilfe der Drahterosionsbearbeitung entworfen und hergestellt. Das MN-Array wurde als 13 × 13-Array mit einem MN-Spitzenabstand von 1 mm entworfen, und jedes MN hatte eine Pyramidenform (1200 µm Höhe) und eine quadratische Basis (620 µm Breite). Eine Mischung aus PDMS und Härter (10:1, w/w) wurde auf die MN-Patrize gegossen, gefolgt von Entgasung und Aushärtung in einem Ofen bei 80 °C für 1 Stunde. Die PDMS-Matrizenform der MNs wurde dann von der Edelstahlform gelöst und anschließend zur Herstellung poröser PLA-MNs verwendet.

Zunächst wurden 6,7 % (Gew./Vol.) PLA in 15 ml Dichlormethan als organische Phase hergestellt und in die Wasserphase eingemischt, die 5 % (Gew./Vol.) Polyvinylalkohol (PVA) als Tensid in entionisiertem (DI) Wasser enthielt. Um PLA-Mikrokügelchen zu erhalten, wurde die Mischung 6 Stunden lang bei 25 °C und 1000 U/min gerührt, bis das Dichlormethan vollständig verdampft war.

Die hergestellte PLA-Mikrokugellösung wurde dann in die vorbereitete PDMS-Matrize gegossen. Nach dem Vakuumieren, um die Mikrokügelchen in die Hohlräume zu füllen, wurde die gesamte Form 2 Stunden lang in einen Konvektionsofen bei 50 °C gestellt, um die Lösung zu verdampfen und die PLA-Mikrokügelchenlösung zu trocknen, um die MN-Struktur zu bilden. Anschließend wurde das MN-Array von der Form abgezogen. Anschließend wurde eine 30-minütige Wärmebehandlung bei einer Temperatur über dem Schmelzpunkt von PLA (170 °C) durchgeführt, um die Mikrokügelchen zum Schmelzen und Verbinden zu bringen. Nach Trocknung und Wärmebehandlung bei vier verschiedenen Temperaturen (170 °C, 180 °C, 190 °C und 200 °C).

Die Porosität der porösen PLA-MNs wurde mithilfe der Wasseraufnahmemethode und poröser PLA-Filme durch Vergleich ihrer Massen vor und nach der Flüssigkeitsextraktion gemessen. Zuerst wurde die Trockenmasse (Wdry) aufgezeichnet, danach wurde der vorbereitete Film in entionisiertes Wasser eingetaucht; Oberflächenwasser wurde entfernt, nachdem die Absorption bis zur Sättigung zugelassen wurde. Anschließend wurde die Masse sofort gemessen und als Wfeß aufgezeichnet. Die Porosität wurde mit der folgenden Gleichung berechnet:

Dabei ist ρp die Dichte von PLA (1,25 g/cm3) und ρ0 die Dichte von DI-Wasser (1,0 g/cm3).

Die Bruchkraft der porösen MNs nach der Wärmebehandlung bei verschiedenen Temperaturen wurde durch die Durchführung axialer Kompressionstests mit kommerziellen Kraft-Verschiebungs-Geräten (MX2-500N; Imada Inc., Toyohashi, Japan) bewertet. Ein einzelnes poröses MN wurde auf eine flache Platte gelegt und durch eine starre Metalloberfläche mit einer Geschwindigkeit von 2 mm/min komprimiert. Die Kompressionskraft und Verschiebung wurden kontinuierlich gemessen, bis das MN brach, und die Knickbruchkraft wurde aufgezeichnet, da die Kraft bei Nadelbruch plötzlich abfiel.

Basierend auf den MN-Abmessungen und den experimentellen Ergebnissen der Versagenskräfte wurde der Elastizitätsmodul (E) der porösen PLA-MNs auf der Grundlage der folgenden Gleichung61,62 berechnet:

wobei L die Höhe des Pyramiden-MN darstellt und P die kritische Knicklast ist, die sich auch auf die MN-Versagenskraft bezieht54. W1 und W2 stellen die Breite des Spitzendurchmessers bzw. der MN-Basis dar. Diese Gleichung hat eine Randbedingung, bei der die MN-Basis fest ist und die MN-Spitze sich frei bewegen kann. Das hergestellte poröse MN-Array erfüllte den Fall der festen Fixierung.

Um die Hautinsertionsfähigkeit von porösen PLA-MNs zu bewerten, wurde Schweinekadaverhaut (K1270; Funakoshi, Tokio, Japan) verwendet, um die menschliche Haut aufgrund ihrer anatomischen und physiologischen Ähnlichkeiten nachzuahmen63. Poröse MNs wurden 1 Minute lang unter Fingerdruck (~ 30 N) in die Schweinehaut eingeführt und dann von der Haut abgezogen. Anschließend wurde die Hautoberfläche 15 Minuten lang mit 1 % (Gew./Vol.) Methylenblau angefärbt und dann mit Ethanol abgewischt. Die von MNs durchdrungenen Stellen wurden mittels Stereomikroskopie (Stereozoom S9D; Leica, Wetzlar, Deutschland) identifiziert. Basierend auf der Beobachtung von Flecken wurde der PE anhand der folgenden Gleichung berechnet:

Das kreisförmige Blankopapier wurde aus einem Filterpapier (Grade 4; Whatman, Maidstone, UK) mit einem Durchmesser von 5 mm hergestellt. Das kreisförmige glukoseempfindliche Papier (Klasse 4) wurde mit Glucoseoxidase und Meerrettichperoxidase als Enzymen und TMB als chromogenem Farbstoff hergestellt, die üblicherweise als kolorimetrische Assays zum Nachweis des Glucosespiegels verwendet werden31,64. Zunächst wurde das enzymatische Mittel durch Mischen von 100 U/ml GOX (145,2 U/mg) und 100 U/ml HRP (279 U/mg) in 1 ml PBS-Puffer mit 250 mM Trehalose als Stabilisator hergestellt. Anschließend wurden 4 µL der vorbereiteten Lösung auf das Papier pipettiert und bei 25 °C getrocknet. Als nächstes wurde das chromogene Mittel durch Auflösen von 15 mM TMB in 1 ml Methanol hergestellt und mit 4 µL auf das gleiche Filterpapier pipettiert und bei 25 °C getrocknet. Die Vorbereitung des glukoseempfindlichen Papierbiosensors und des leeren Papiers wurde abgeschlossen und mit transparentem Klebeband am MN-Array befestigt, wie in Abb. S5a dargestellt.

Luminol-Lösung wurde in großem Umfang eingesetzt, um das Vorhandensein von Blut mittels Chemilumineszenzreaktion zu überprüfen65. Die Lösung wurde durch Auflösen von 0,1 g Luminol, 5 g wasserfreiem Natriumcarbonat und 15 ml 30 %iger Wasserstoffperoxidlösung in 100 ml entionisiertem Wasser hergestellt und im Dunkeln gelagert.

Sprague-Dawley-Ratten (CLEA, Tokio, Japan) im Alter von zehn Wochen wurden verwendet, um die Hauterholung nach einer MN-Behandlung zu charakterisieren. Zuerst wurde die Ratte in die mit 5 % Isofluran vorgefüllte Induktionskammer mit einer Durchflussrate von 2,5 l/min unter Verwendung eines Inhalationsanästhesiegeräts für Nagetiere (WP-SAA01; LMS, Tokio, Japan) gebracht und betäubt. Nach Einleitung der Inhalationsnarkose wurde die Ratte auf eine Heizplatte gebracht, um ihre Körpertemperatur aufrechtzuerhalten. Dann wurde die Ratte mit einer Nasenmaske bedeckt und während der Haarentfernung und des MN-Penetrationstests wurde 2 % Isofluran mit einer Durchflussrate von 2,5 l/min aus einem Inhalator verabreicht. Das Haar der Rückenhaut der Ratte (2 cm × 2 cm) wurde mit einem Elektrorasierer rasiert und anschließend 1 Minute lang mit 0,5 g Enthaarungscreme versehen, so dass nach dem Entfernen der Enthaarungscreme mit feuchten Tüchern die freiliegende Rattenhaut erhalten blieb. Um physische Schäden an der Ratte zu vermeiden, wenn beim MN-Einführen eine kontinuierliche Kraft ausgeübt wird, wurde die Rückenhaut der Ratte auf einer 3D-gedruckten PLA-Plattform fixiert (Abb. 4d1). Das mit vorbereiteten Papieren befestigte poröse MN-Array wurde auf die Rückenhaut gelegt und mit einer Daumenkraft (~ 30 N) 5 Minuten lang angelegt und dann zur weiteren Beobachtung abgezogen. Die vorbereitete Luminollösung wurde auf das leere Papier gesprüht, um zu bestätigen, ob Blut in der extrahierten Flüssigkeit vorhanden war. Der Tierversuch wurde von der Forschungsethikkommission des Institute of Industrial Science der Universität Tokio genehmigt (Ethikgenehmigungsnummer: 03–05 im Jahr 2021) und diese Studie wurde in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt.

Zur Herstellung der mit dem SARS-CoV-2-Spike-Protein RBD konjugierten AuNPs wurden 10 µg rekombinantes SARS-CoV-2-Spike-Protein RBD zu einer Mischung aus 1 ml AuNP-Kolloid (40 nm Durchmesser, OD = 12) und 0,1 ml Borat gegeben Puffer (0,1 M, pH 8,5), um die Bindung von Proteinen an die Oberfläche von AuNPs zu erleichtern. Nach 30-minütiger Inkubation bei 25 °C wurden 100 µL BSA (10 mg/ml) hinzugefügt, um die AuNP-Oberfläche zu blockieren. Nach 15-minütiger Inkubation bei 25 °C wurden die Proben 20 Minuten lang bei 4 °C und 8600 g zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand verworfen und 1 ml BSA (1 mg/ml) zugegeben, um die konjugierten AuNPs zu resuspendieren. Ihre Oberfläche wurde wieder blockiert und das ungebundene Spike-Protein entfernt. Die Zentrifugations- und Resuspensionsschritte wurden zweimal wiederholt und für die abschließende Resuspension wurde 1 ml PBS verwendet. Kaninchen-IgG-konjugierte AuNPs wurden nach dem gleichen Verfahren hergestellt.

Das Probenkissen wurde durch Zuschneiden in eine Größe von 1 cm × 1 cm und anschließendes Eintauchen in die Vorbehandlungslösung mit 0,5 % (Gew./Vol.) BSA und 0,05 % (V/V) Tween-20 in PBS vorbereitet, bis es vollständig nass war. Anschließend wurde das Probenkissen 2 Stunden lang bei 37 °C in einem Ofen getrocknet.

Das Konjugatkissen wurde auf eine Größe von 5 mm × 5 mm geschnitten, mit einem Puffer vorbehandelt, der 5 % (Gew./Vol.) Saccharose, 1 % (Gew./Vol.) BSA und 0,1 % (V/V) Tween-20 enthielt 2 h bei 37 °C getrocknet. Hier wurde Saccharose verwendet, um die Stabilität des Proteins nach der Dehydrierung zu bewahren und die schnelle Wiederlösung bei Benetzung zu verbessern66. Anschließend wurde das Konjugatpad nacheinander mit den vorbereiteten SAR-CoV-2-Spike-Protein-RBD-konjugierten AuNPs und Kaninchen-IgG-konjugierten AuNPs beschichtet und dann bei 37 °C getrocknet.

Der Fänger-Anti-Human-IgM-Antikörper, der Anti-Human-IgG-Antikörper und der Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper wurden mit einem Polyestertupfer mit scharfer Spitze (200-CD055; Sanwa Direct, Okayama, Japan) als IgM-Test, IgG-Test bzw. Kontrolllinien. Die IgM-Linie wurde 7 mm von einem Ende der NC-Membran entfernt gedruckt und der Abstand zwischen den beiden Linien betrug 4 mm. Anschließend wurde die NC-Membran mit 2 % (Gew./Vol.) BSA in PBS blockiert, gefolgt von Waschen mit 0,05 % (V/V) Tween-20 in PBS und dann 30 Minuten bei 37 °C getrocknet. Das Adsorptionspad wurde ohne jegliche Behandlung mit einer Überlappung von 1–2 mm mit der NC-Membran befestigt.

Nachdem sich das kolorimetrische Signal in den Test- und Kontrolllinien stabilisiert hatte, wurden die Erkennungsfelder in eine Box gelegt und mit einer Kamera (D5500; Nikon, Tokio, Japan) Bilder aufgenommen. Die Einrichtungsbedingungen, einschließlich der Kameraparameter, der Lichtquelle und des Abstands zwischen Erkennungsfeld und Kamera, wurden festgelegt und während der Bildaufnahme konstant gehalten. Als nächstes wurde das Bild in ImageJ (National Institute of Health, Bethesda, MD, USA) importiert und der grüne Kanal ausgewählt, da er die höchste Empfindlichkeit für die Analyse roter Markierungen wie AuNPs66 bietet. Entlang der NC-Membran wurde eine gerade Linie gezogen. Die Breite der geraden Linie wurde so angepasst, dass sie den größten Teil des Streifens abdeckt, um die Reproduzierbarkeit zu erhöhen. Anschließend wurde die Spitzenintensität der Testlinien (IgM oder IgG) nach dem Testen verschiedener Konzentrationen gemessen, indem der Spitzenintensitätswert vom Hintergrundintensitätswert abgezogen wurde. Anschließend wurden die Daten in die Origin-Software (2021b; OriginLab, Northampton, MA, USA) importiert und die beste Datenanpassung mithilfe einer Logistikkurve mit vier Parametern für die statistische Analyse einschließlich LoD-Bestimmung für IgM/IgG erzielt. Alle Methoden, einschließlich Tierversuche, wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften (den ARRIVE-Richtlinien 2.0) durchgeführt, und wie bereits erwähnt, wurden alle Tierversuche von der Forschungsethikkommission des Institute of Industrial Science der Universität Tokio, Japan, genehmigt.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel (und seinen ergänzenden Informationsdateien) enthalten.

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Diese Arbeit wurde vom Core-to-Core-Programm A (JETMeE) der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) unterstützt. Die Autoren danken Prof. Kai Chieko, Prof. Yoneda Misako und Dr. Soojin Shim für ihre Ratschläge zur Entwicklung der Immunoassay-Biosensorik und Frau Kinoshita für die Unterstützung bei Tierversuchen. Der Cartoon der Ratte in Abb. S5a der Zusatzinformationen wurde mit BioRender.com erstellt.

Diese Forschung wurde vom Core-to-Core-Programm A der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (Fördernummer JPJSCCA20190006), Japan, unterstützt.

Institut für Industriewissenschaften, Universität Tokio, 4-6-1 Komaba, Meguro-ku, Tokio, 153-8505, Japan

Leilei Bao, Jongho Park, Boyu Qin und Beomjoon Kim

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BK hat das Projekt initiiert. LB entwickelte die Herstellungsmethode und entwarf und charakterisierte das Gerät. LB, JP und BQ führten die Experimente durch und analysierten die Daten. LB hat die Originalarbeit geschrieben. JP, BQ und BK haben das Manuskript überprüft und kommentiert. Alle Autoren überarbeiteten das Werk kritisch und stimmten der endgültigen Fassung zu.

Korrespondenz mit Beomjoon Kim.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Bao, L., Park, J., Qin, B. et al. Nachweis von Anti-SARS-CoV-2-IgM/IgG-Antikörpern mithilfe eines Patch-Sensors, der poröse Mikronadeln enthält, und eines papierbasierten Immunoassays. Sci Rep 12, 10693 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-14725-6

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Eingegangen: 16. März 2022

Angenommen: 10. Juni 2022

Veröffentlicht: 01. Juli 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-14725-6

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